一、人玻璃体液对培养的视网膜色素上皮细胞形态及骨架蛋白表达的影响（论文文献综述）
王甜[1]（2020）在《外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变中的治疗作用研究》文中指出研究目的:目前,对外伤性视神经病变（Traumatic optic neuropathy,TON）的治疗尚无明确有效的方法。临床上主要以激素和手术治疗为主,但二者的疗效不确切且尚无循证医学研究的支持。生物多肽因其高特异性有望成为TON治疗的新型药物。但是,肽类存在易降解,不稳定和半衰期短的问题,且很多普通肽细胞膜渗透和组织穿透能力很弱,难以穿过眼部屏障。这限制了它们作为治疗剂的用途,同时也对多肽递送系统提出了挑战。本研究旨在利用视神经钳夹（Optic nerve crush,ONC）模型模拟TON的急性视神经损伤过程,首先探讨不同致伤冲量与视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell,RGC）及其轴突丢失的关系,以期深入理解疾病进程,科学选择疾病治疗的时机;其次,构建可高效负载神经肽的外泌体（exosome）新型生物纳米载药系统;最后,基于体内大鼠ONC模型,评估其在TON治疗上的可行性和应用潜力。方法:1.大鼠视神经钳夹模型的探究。1)利用自闭合反向夹持镊,在距视盘1.5mm处进行右侧视神经钳夹,钳夹时间分别为5s,10s,20s,建立不同损伤强度的SD大鼠视神经损伤模型,行Masson视网膜切片染色,评估模型成功建立。2)在不同钳夹时间下,于伤后1、3、5、7、14、21、28天行视网膜切片hematoxylin-eosin（HE）染色,评估视网膜组织的病理形态改变。3)在不同钳夹时间下,于伤后7、14、21、28、35天行SD大鼠OCT扫描观,评估视网膜的神经纤维层（Retinal nerve fiber layer,RNFL）的厚度变化。4)在不同钳夹时间下,于伤后7、14、21天行视网膜铺片检测βⅢ-tubulin+轴索数量,评估视网膜内神经纤维的丢失情况,行视网膜铺片检测RBPMS+RGC数量,评估视网膜神经节细胞的死亡情况。2.外泌体负载神经肽PACAP（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）系统的构建。1)从不同种类的视网膜细胞系中,利用超速离心法获得视网膜细胞外泌体。利用电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪及Western blot对其进行形态学、粒径范围及特征蛋白表达谱的鉴定。2)利用扫描激光共聚焦显微镜检测视网膜神经节细胞对DIR标记的exosome的摄取。3)利用流式细胞术检测不同视网膜细胞来源的外泌体与神经保护肽PACAP38的连接效率。4)利用扫描激光共聚焦显微镜检测视网膜神经节细胞对不同视网膜细胞来源exosome所负载的FITC标记的CP05-PACAP38的摄取并利用流式细胞术分析其摄取率。3.体内神经保护作用。1)利用视网膜铺片检测RBPMS+RGC数量,评估网膜神经节细胞的存活。2)利用OCT评估视网膜RNFL的厚度。3)利用Western blot及视神经切片免疫荧光染色检测神经再生蛋白GAP-43的蛋白表达,评估视神经的再生潜力。4)利用霍乱毒素B进行视神经示踪,评估距离钳夹部位不同距离的视神经再生数量。5)利用闪光视觉诱发电位（Flash visual-evoked potential,FVEP）进行N2P2波形的振幅及潜伏期检测,评估视神经功能。结果:（1）大鼠视神经钳夹模型的探究。1)视神经钳夹痕迹,指示造模成功。2)组织病理学检测显示从损伤第3天开始出现节细胞数目减少,于损伤第7天出现视网膜核层排列紊乱,此时尚未观察到RNFL及全层厚度变化,于损伤14天开始出现RNFL变薄,视网膜全层变薄,视网膜核层出现不同程度的紊乱。不同损伤程度的各组间无肉眼可见的显着差异。3)OCT结果显示损伤14天时RNFL明显变薄,一直延续到损伤21天,之后RNFL厚度减少趋势相对稳定,虽仍有下降但无统计学差异。不同损伤程度的各组间无肉眼可见的显着差异,神经轴索的βⅢ-tubulin+染色支持OCT结果。在损伤后的同一时期,RGC轴索的丢失程度与损伤冲量有关。4)RBPMS+RGC染色显示,视网膜神经节细胞于损伤第一周时大幅减少,于损伤第二周呈中度下降,相比于第一周下降比例有所缓和,之后RGC数目仍继续衰减,下降幅度趋于平稳。在损伤后的同一时期,RGC丢失程度随损伤冲量的增加而加重,差异有统计学差异。（2）外泌体负载神经肽PACAP38系统的构建。1)RGC源性外泌体(EXORGC)可以高效负载PACAP38进入RGC。2)流式结果显示FITC-CP05-PACAP38与EXORGC的连接效率为92.8%。3)流式结果显示FITC-PACAP38体外细胞摄取率为5.22%,EXORGC负载FITC-PACAP38系统(EXORGC-PACAP38)可使FITC-PACAP38体外细胞摄取率提高至95.7%。4)体内视网膜铺片结果显示相同时间内EXORGCRhodamine B-CP05-PACAP38系统可以提高Rhodamine B-PACAP38被视网膜组织摄取的效率。（3）体内神经保护作用。1)视神经损伤1周。i)损伤组RGC数量为706.31±15.8/mm2,EXORGC对照组为783.63±7.06/mm2,PACAP治疗组为791.37±10.63/mm2,EXORGC-PACAP38治疗组为865.22±18.42/mm2。PACAP38治疗组和EXORGCPACAP38疗组与损伤组相比均有统计学意义。EXORGC-PACAP38治疗组RGC存活率最高,与单纯的PACAP38治疗组相比有统计学意义。ii)OCT结果显示各组之间无统计学差异iii)F-VEP结果显示EXORGC-PACAP38治疗组和PACAP38治疗组相比于损伤组P2波潜伏期缩短,但两治疗组间无统计学差异。两治疗组较损伤组均不能改善P2波的振幅。2)视神经损伤2周。i)损伤组RGC数量为76.84±7.63/mm2,EXORGC对照组为90.48±3.6/mm2,PACAP治疗组为141.79±12.77/mm2,EXORGC-PACAP38治疗组为195.63±11.09/mm2。PACAP38治疗组和EXORGC-PACAP38治疗组与损伤组相比均有统计学意义。EXORGC-PACAP38治疗组RGC存活率最高,与单纯的PACAP38治疗组相比差异有统计学意义。ii)EXORGC-PACAP38治疗组相较与损伤组,可挽救RNFL的厚度的下降,差异有统计学差异。PACAP38不能挽救RNFL厚度的下降。iii)EXORGC-PACAP38治疗组较损伤组及PACAP38治疗组,Gap43的蛋白表达升高,差异有统计学意义。PACAP38不能增加视神经中Gap43的蛋白表达。iv)视神经的CTB示踪显示EXORGC-PACAP38治疗组的视神经再生能力最强,相比于损伤组或单纯的PACAP38治疗组,差异均有统计学意义。v)EXORGC-PACAP38治疗组较损伤组P2波振幅增高,潜伏期缩短,差异有统计学意义。PACAP38治疗组不能改善P2波的潜伏期。（4）毒性试验。治疗剂量的EXORGC-PACAP38未造成视网膜组织组织病理学改变,视网膜各层厚度改变,对应的眼底成像系统未见异常,未造成N2P2波振幅和潜伏期的异常。结论:1.在SD大鼠的视神经钳夹模型中,RGC的死亡和RNFL的变性丢失过程均分为两个阶段发生,即快速丢失阶段和缓慢丢失阶段。但是,二者并不同步,RGC的死亡先于视网膜内轴突的丧失,RGC丢失幅度大于RNFL变薄的幅度。在ONC后的同一时期,RGC丢失程度随损伤冲量的增加而加重,而RGC轴索的丢失程度与损伤冲量无关。2.PACAP38在大鼠ONC模型中发挥了一定的神经保护作用但是不能促进视神经再生。3.视网膜不同细胞来源的外泌体可以作为新型生物纳米载药系统,通过exosome锚定肽CP05与神经保护肽PACAP38形成连接复合体。加载了神经保护肽PACAP38的exosome仍可保持自身结构的稳定性。其中,视网膜神经节细胞源性外泌体相比于所测试的其他眼源性RPE细胞外泌体和Müller细胞外泌体展现出更高的PACAP38负载效率。在体外,可以增加源细胞RGC对PACAP38的摄取,大大提升了PACAP38与源细胞RGC相互作用的能力。在体内,可以迅速穿越视网膜内界膜屏障,布散至视网膜内层组织。4.EXORGC-PACAP38在大鼠ONC模型中介导高效的神经保护和神经再生效应,起到延缓RGC的丢失及促进视神经轴索再生进而改善视神经功能的作用。
王梦华[2]（2018）在《外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的蛋白质组学分析以及分子机制研究》文中认为背景:作为眼外伤的一种严重的并发症,增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是视网膜复位术后失明的主要原因,其主要特征是眼外伤后视网膜色素上皮细胞过度的增殖,迁移和收缩。PVR的形成机制很复杂,目前对其理解仍然不够透彻。在PVR中,蛋白表达谱发生了明显变化,蛋白质组学作为一种鉴定和定量技术可为包括PVR在内的多种疾病的早期诊断和临床治疗提供分子标志和作用靶点,基于此我们可将差异表达的蛋白进行深入研究。目的:首先,对外伤性PVR患者的视网膜和正常人眼的视网膜进行蛋白质组学分析,以找出两种状态下视网膜组织中存在的差异表达蛋白,力求为外伤性PVR的发病机制提供新的依据,并为PVR的预防和治疗寻找新的突破口。接着,在人视网膜色素上皮细胞（Human retinal pigment epithelial,RPE）系ARPE-19细胞中敲降人视网膜特异性ATP结合盒转运体（ABCA4）的表达,研究其对RPE细胞活力、增殖、凋亡和迁移能力的影响,为外伤性PVR的防治提供新思路。方法:在蛋白质组学分析中,（1）获取实验组和对照组视网膜标本,并用BCA法对其蛋白浓度定量;（2）运用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色对蛋白质的提取进行评估;（3）对提取蛋白质进行高效液相色谱-质谱（high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry,HPLC-Chip MS/MS system）分析;（4）采用Label-free对样品进行定性定量分析;（5）对鉴定的差异蛋白质进行生物信息学分析:GO富集分析,KEGG通路分析,层次聚类分析;（6）运用RT-qPCR和Western blot对鉴定出的显着上调的差异蛋白ABCA4进行表达验证。在研究ABCA4作用机制的实验中:（1）我们在RPE细胞系ARPE-19中转染特异性靶向ABCA4的小干扰RNA,siABCA4或非特异性的对照siRNA,siNC。利用qRT-PCR和western blot测定ABCA4的表达水平。（2）在ABCA4敲降的RPE细胞或对照细胞中利用MTT比色法检测细胞活力随培养时间变化。（3）利用流式细胞术结合Annexin V-FITC或PI染色比较两组细胞周期和凋亡变化。（4）采用划痕实验检测ABCA4敲降和非敲降细胞迁移能力的大小。（5）此外,采用western blot法检测两组细胞细胞增殖、周期和凋亡相关蛋白的表达水平。结果:在蛋白质组学研究中我们发现:（1）外伤性PVR患者视网膜蛋白质浓度为19.7 ug/ul,此数值略高于正常人视网膜中的蛋白质浓度（14.1μg/ul）;（2）本实验中蛋白提取的效果良好,且与正常捐献者视网膜蛋白表达相比,外伤性PVR患者的视网膜中蛋白浓度较高,表现为高丰度蛋白质所占的比例较大。（3）LC-MS/MS分析共分离和鉴定到捐献眼和外伤性PVR视网膜中肽段数25305个,蛋白质组数3541个。（4）Label-free分析共鉴定出3518个蛋白质,其中241个为差异表达蛋白。（5）GO富集分析的结果表明,所鉴定的差异蛋白质共涉及了 18个生物学过程,15个分子功能和9个细胞组分。其中包含差异蛋白数目最多的前五个生物学过程依次是:多细胞生物过程,单-多细胞生物过程,细胞周边反应,质膜,外部刺激响应。（6）KEGG分析的结果表明,所鉴定蛋白质参与最多的前5个通路依次是:亨丁顿舞蹈症,氧化磷酸化,焦点黏连,阿尔兹海默症,非酒精性脂肪肝。（7）层次聚类分析的结果表明,在241个差异蛋白中,上调表达蛋白共88个,下调表达蛋白共153个。（8）RT-qPCR和western blot检测的结果表明,ABCA4在外伤性PVR中表达显着上调。ABCA4的功能研究结果发现:（1）通过转染ABCA4特异性的siRNA,siABCA4成功在RPE细胞系ARPE-19中抑制了 ABCA4的表达,构建了 ABCA4低表达的ARPE-19细胞。与转染对照非特异性的siRNA相比,转染了 siABCA4的细胞,细胞活力随培养时间的增加显着受到了抑制。Western blot测定增殖细胞相关抗原不溶性增殖细胞核抗原（Proliferating cel l nuclear antigen,PCNA）和 Ki67 的结果表明:转染 siABCA4 的细胞PCNA和Ki67表达量显着降低,表明正常增殖细胞数目的减少。（2）PI染色结合流式细胞术对两种细胞的细胞周期研究结果显示:与转染对照siRNA的细胞相比,转染siABCA4的细胞,处于G0/G1期的细胞所占比例明显上调,而处于S期和G2/M的细胞所占比例明显降低,表明转染siABCA4降低ABCA4的表达引起RPE细胞系ARPE-19细胞周期G0/G1期停滞。分子机制研究发现p21,也被称为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（cyclin-dependent kinase inhibitor 1,CDKN1）或 CDK 1 相互作用蛋白 1（CDK-interacting protein 1,CDK 1）在ABCA4低表达的ARPE-19细胞中蛋白表达明显提高;而两种促进细胞周期进展的细胞周期调控蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶4（Cyclin-dependent kinase 4,CDK4）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达显着降低。（3）Annexin V-FITC染色结合流式细胞术对两种细胞的细胞凋亡的研究发现,与转染对照非特异性siRNA的细胞相比,转染siABCA4的细胞,早期和晚期凋亡细胞比例均明显提高。分子机制研究发现,与ABCA4正常表达的细胞相比,促细胞凋亡蛋白Bax和Bad在ABCA4低表达的ARPE-19细胞中蛋白表达明显提高。（4）划痕实验的研究结果表明,与转染非特异性对照siRNA相比,转染特异性siABCA4降低ABCA4表达的RPE细胞迁移能力显着降低。结论:（1）外伤性PVR患者与正常人视网膜中共存在241种差异表达蛋白,包括88个上调蛋白和153个下调蛋白。（2）ABCA4在外伤性PVR视网膜中显着上调,表明其可能在PVR发生发展中起着关键作用。（3）在RPE细胞系ARPE-19细胞中转染特异性靶向ABCA4的小干扰RNA,siABCA4可以降低ABCA4的表达,构建ABCA4低表达的ARPE-19细胞。（4）在RPE细胞中使用siABCA4降低ABCA4的表达可抑制细胞活力随培养时间增加,细胞增殖并诱导其发生细胞凋亡。（5）siABCA4对RPE细胞活力,增殖和凋亡的作用可能与细胞周期调节蛋白p21,CDK4和Cyclin D1的异常表达以及促细胞凋亡蛋白Bax和Bad表达增加相关。（6）在RPE细胞中使用siABCA4抑制ABCA4的表达可降低RPE细胞迁移能力。（7）ABCA4有潜力成为外伤性PVR防治的靶点。
余丰[3]（2018）在《三七防治兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究》文中指出目的:本实验通过制作兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变（traumatic proliferative vitreoretinopathy,t PVR）模型,观察中药三七对外伤性增殖性玻璃体视网膜病变兔视网膜中转化生长因子-β（TGF-β）及肝细胞生长因子（HGF）表达的影响,探讨中药三七对兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的防治作用。方法:采用巩膜穿通伤联合富含血小板的血浆玻璃体腔注入的方法制成外伤性PVR兔模型,将动物分成空白组、模型组、阳性对照组、三七低剂量组及三七高剂量组,三七治疗组给予不同剂量的三七粉混悬液进行灌胃,连续28天,阳性对照组一次性给予道诺霉素玻璃体腔注射,采用免疫组织化学分析的方法对兔视网膜中转化生长因子-β（TGF-β）及肝细胞生长因子（HGF）的表达进行检测和分析。结果:（1）各组眼底增生级数:给药后第1天,各组间的比较不具有统计学意义（P=0.296）;给药第7天后各组间的比较具有统计学意义（P<0.01）,且模型组与空白组的比较具有显着统计学意义（P<0.01）,阳性对照组及三七高剂量组的PVR分级低于模型组（P<0.01）,三七低剂量组与模型组的比较没有统计学意义（P>0.05）,三七高剂量组与阳性对照组间的比较没有统计学意义（P>0.05）。（2）各组的眼底增殖膜截面积:模型组兔眼底增殖膜截面积明显高于正常组,具有显着统计学意义（P<0.01）;阳性对照组、三七高剂量与模型组的比较具有显着统计学意义（P<0.01）,而三七低剂量组与模型组的比较不具统计学意义（P>0.05）。（3）各组视网膜中转化生长因子-β（TGF-β）表达情况:与空白组相比,模型组视网膜中TGF-β蛋白含量明显升高,具有显着统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,阳性对照组及三七高剂量组中TGF-β蛋白含量降低,具有显着统计学意义（P<0.01）,三七低剂量组中TGF-β蛋白含量亦降低,具有统计学意义（P<0.05）。（4）各组视网膜中肝细胞生长因子（HGF）表达情况:与空白组相比,模型组兔视网膜中HGF蛋白含量明显升高,具有显着统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,三七低剂量组HGF蛋白含量无明显差异（P>0.05）,阳性对照组、三七高剂量组HGF蛋白含量明显降低,具有显着统计学意义（P<0.01）。结论:本研究通过巩膜穿通伤联合富含血小板的血浆玻璃体腔注入的方法成功制成了兔外伤性PVR模型。研究发现中药三七可减轻外伤性PVR兔眼底的增生程度及抑制眼底增殖膜的形成,同时可降低TGF-β、HGF在视网膜上的表达,从而起到防治外伤性PVR的作用。
朱邵品[4]（2017）在《新型生物肽抑制眼部纤维化疾病作用及机制研究》文中研究说明目的:眼部纤维化疾病包括增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）,青光眼滤过术后疤痕,角膜疤痕等。这类疾病易致盲,难治疗,临床缺少安全有效药物。本课题从人体内源性蛋白骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）中筛选出具有关键活性位点的新型生物肽BP2,并评估其在眼部纤维化疾病模型中的有效性,安全性及机制。方法:（1）多肽筛选:采用生物信息学方法从BMP-7蛋白中筛选出三段不同位点多肽,BP1,BP2及BP3。MTS方法检测多肽对人RPE-19细胞正常增殖及生长因子诱导下异常增殖的影响,划痕方法检测多肽对人RPE-19细胞机械性迁移的作用。（2）多肽体内外抑制PVR有效性:体外Transwell方法,光学观察,胶原牵拉实验,免疫荧光方法检测不同浓度梯度的多肽BP2作用下,人RPE-19细胞迁移能力的改变,对转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）诱导下细胞形态改变的作用,以及细胞胶原牵拉的作用及RPE细胞发生上皮-间质性转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）过程中关键蛋白的表达。此外通过体内建立兔眼PVR动物模型,给予BP2多肽眼内注射干预,通过检眼镜,B超,眼底照相,大体剖开,组织病理学,HE及MASSON染色观察眼内增殖膜以及网脱发生情况。（3）多肽体内外干预青光眼滤过术后疤痕有效性:在体外原代培养人Tenon’s囊成纤维细胞（Human Tenon’s Fibroblasts,HTF）,通过MTS法检测BP2干预下HTF细胞活力,流式细胞术检测凋亡,胶原牵拉检测细胞收缩能力,免疫荧光检测HTF细胞由成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中关键蛋白表达改变。体内建立兔眼青光眼滤过术模型,观测BP2与丝裂霉素（mitomycin,MMC）分别干预后的滤过泡形态,眼压,滤过泡组织病理学改变。（4）多肽抑制其它疤痕模型的效果:通过BP2对体外培养人角膜细胞（human corneal fibroblasts,HCF）增殖活力影响,机械迁移改变,炎症因子水平,EMT转化过程中关键蛋白表达的改变,初步探讨多肽对角膜疤痕的抑制效果;通过建立体外兔耳皮肤疤痕模型,给予BP2皮下注射观察多肽干预皮肤疤痕的效果。（5）多肽在动物体内作用的安全性:通过临床观察,组织病理学检查,眼压,电生理,电镜微结构检测,评估BP2眼内注射的安全性。（6）多肽抑制纤维化机制:通过Western检测EMT转化中关键标记蛋白表达,纤维化关键通路Smad磷酸化水平改变,探讨BP2抑制纤维化的可能机制。结果:（1）筛选出活性肽BP2:从母蛋白BMP-7中初筛选出三段多肽BP1,BP2及BP3。通过体外实验从初筛多肽中确定BP2生物活性最佳。（2）多肽BP2有效抑制体内外PVR模型:BP2干预后RPE细胞趋化能力下降,细胞在TGF-β刺激下的形态改变及收缩能力明显低于诱导组（p<0.05）,所表达的EMT标记蛋白:α-平滑肌机动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）及紧密连接蛋白-1（zonula occludens-1,ZO-1）)在EMT转化过程中的改变均受到显着抑制。在体内,BP2玻璃体腔注射能够减轻兔眼PVR模型中增殖膜的形成,网脱发生率较未干预组减少60%。（3）多肽BP2有效干预体内外青光眼滤过术后疤痕:BP2能有效抑制HTF细胞向肌成纤维细胞转化以及青光眼滤过泡疤痕形成。BP2对HTF细胞正常生长无影响,细胞凋亡明显低于MMC组（p<0.05）,BP2能够降低HTF细胞收缩牵拉能力,对TGF-β诱导后细胞骨架蛋白,α-SMA蛋白及胶原表达起到抑制作用。在体内BP2能够维持滤过泡形态,对疤痕的抑制作用虽不及MMC显着,但眼部副作用明显低于MMC组。（4）多肽BP2抑制其它疤痕模型:多肽能够抑制体外角膜细胞机械迁移,炎症因子水平,及α-SMA表达（p<0.05）。能够减轻兔耳皮肤疤痕模型中疤痕严重程度。（5）多肽动物体内作用安全性:多肽对兔眼微结构,电生理功能及眼压无明显影响,安全性良好。（6）多肽抑制纤维化机制:多肽通过抑制Smad2,Smad3磷酸化及EMT中重要蛋白表达发挥抑制纤维化作用。在Western检测中BP2显着抑制RPE,HTF,HCF三种细胞在TGF-β诱导后α-SMA,ZO-1,上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）,纤维连接蛋白（Fibronectin）及I型胶原蛋白collagen type I alpha1（Col1α1）的表达改变（p<0.05）,及Smad2,Smad3磷酸化水平（p<0.05）。结论:通过生物信息学筛选的新型生物肽BP2能够安全,有效抑制体内外眼部纤维化疾病模型,包括PVR、青光眼滤过术后疤痕、角膜疤痕及皮肤疤痕。其抗纤维化机制可能通过抑制Smad2/3通路,降低EMT转化及胶原表达实现。BP2作为安全性佳,分子量低的新型天然抗纤维化多肽,有望向临床抗纤维化药物转化。
侯佳,王晋芬[5]（2017）在《色素上皮衍生因子对高糖中小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响》文中研究指明目的探讨外源性色素上皮衍生因子（PEDF）对体外高糖培养的小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响。方法在体外培养的小鼠视网膜毛细血管周细胞无血清达氏修正依氏培养基（DMEM）中加入不同浓度葡萄糖（5.5、40、50 mmol/L）,并加入浓度为1 g/L的PEDF 1μl,于4 d后检测不同糖浓度中小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡情况。结果未加PEDF组高糖浓度组与对照组相比,凋亡率差异有统计学意义（P<0.01）,且糖浓度与周细胞凋亡率呈正相关（P<0.01）。加PEDF的糖浓度5.5 mmol/L组,周细胞凋亡率为（7.5±1.5）%,与未加PEDF的对照组（9.6±0.6）%差异无统计学意义（P=0.139）。未加PEDF高糖浓度组（40、50 mmol/L）,呈现出典型的细胞凋亡特征,周细胞凋亡率为（34.8±4.6）%和（41.2±2.2）%。加PEDF高糖浓度组,周细胞凋亡率分别为（17.5±1.7）%和（19.5±3.7）%。2组相比,凋亡率差异有统计学意义（P<0.01）。结论外源性色素上皮衍生因子可有效抑制周细胞的凋亡,细胞凋亡是糖尿病视网膜病变中毛细血管周细胞早期丧失的一种方式。本研究为临床治疗糖尿病视网膜病变提供一定的理论依据。
任彦新[6]（2016）在《姜黄素在增殖性玻璃体视网膜病变中对表皮生长因子的作用》文中认为增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是1983年由美国视网膜专家协会提出用来描述孔源性视网膜脱离（rhegmatogenous retinal detachment,RRD）等疾病后玻璃体和/或视网膜前后面特异细胞增殖形成可以收缩的细胞性膜,进而引起视网膜牵拉、脱离与固定的一种病变,是一种常见的难治性致盲性眼病。据报道,5%10%的RRD可继发PVR,而在复发性视网膜脱离（retinal detachment,RD）中,PVR的发生率增至75%。近年来,随着对PVR病理机制研究的逐渐深入,越来越多的研究发现表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）在RPE细胞的迁移、增生中起重要作用,是促进RPE细胞发生迁移进而发生PVR过程的关键因素之一。目前,临床上治疗PVR的主要方法就是玻璃体视网膜手术,但手术治疗效果并不理想,术后PVR的复发率较高。因此,随着对各种细胞和生长因子在PVR致病过程中作用机制了解的加深,针对PVR发展的不同阶段和相关因子采取不同药物来预防和治疗PVR成为目前进行研究的热点,并成为主流趋势。到现阶段为止,药物研究主要集中在西药领域,主要包括以下几类:皮质类固醇、维生素及其衍生物、抗代谢药、细胞外基质合成抑制剂和细胞信号转导抑制剂等。虽然应用西药来防治PVR的研究已有数年之久,但是由于其在眼内有较大的毒副作用、较单一的药理作用、较昂贵的价格等诸多的局限性致使迄今仍无一种特效的药物能够成功的在临床上得到广泛的应用。目前在西药上的研究难以取得突破性进展,那么应用我国传统中药来防治PVR的研究成为了充满希望的突破方向。中药具有药源丰富、作用广泛且毒副作用小等诸多优点,姜黄素是存在于姜科姜黄属植物根茎中的一种天然的中药单体成分,具有多种药理作用,例如抗炎症、抗细胞增生、抗微生物等。姜黄素的药理作用可以满足PVR防治药物的条件,并且安全性高、毒性低、药源广泛、价格低廉。我们的前期研究发现姜黄素具有抑制视网膜色素上皮细胞增殖的作用,那么姜黄素对在PVR形成过程中起重要作用的表皮生长因子是否有作用,本课题分别通过体外细胞实验和体内玻璃体腔注射姜黄素的动物实验研究姜黄素在pvr防治过程中对egf的作用和相关机制,为pvr的防治提供依据。第一部分表皮生长因子对体外培养的rpe细胞的作用及其在rpe细胞内的表达目的:研究egf对体外培养的兔rpe细胞的作用,探讨egf促进rpe细胞增殖的最佳质量浓度;观察egf在rpe细胞内的表达情况。方法:提取、培养青紫蓝兔rpe细胞,传至第三代并鉴定后,选取生长状态良好的第3代rpe细胞进行实验。将rpe细胞种植在载玻片上制备成细胞爬片,做免疫细胞化学染色进行rpe细胞鉴定和观察rpe细胞内egf的表达情况;将egf分为3、6、9、12ng/ml不同浓度组及空白对照组（10%fbs.dmem）4组;每组各设6个复孔,共接种3块培养板,加药后于24、48、72h随机抽取1块培养板采用四甲基偶氮唑盐（mtt）比色法检测不同浓度的egf在不同作用时间对rpe细胞增殖的影响。结果:rpe细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含有丰富黑色素颗粒,免疫细胞化学染色提示角蛋白表达强阳性。egf在兔rpe细胞的细胞质中表达阳性,呈棕黄色。在相同时间点、不同浓度egf作用下,rpe细胞的吸光度（od值）随egf的浓度增加而增加,且与对照组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。egf浓度≥9ng/ml的相邻浓度实验组两组间比较差异无统计学意义（p>0.05）。在相同浓度的egf作用下,rpe细胞吸光值（od值）随时间的增加而增加,且与相邻组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:体外培养可以获得大量rpe细胞并可用于体外实验研究;egf在兔rpe细胞的细胞质中表达;egf对体外培养兔rpe细胞增生的调控存在一定的剂量-效应关系、时间-效应关系。egf对rpe细胞的促生长作用在9ng/ml以上逐渐达到饱和。研究结果提示:促体外培养的兔rpe细胞增殖的egf的最佳浓度为9ng/m1。第二部分姜黄素对体外培养的rpe细胞中egf表达的抑制作用目的:研究不同浓度的姜黄素对体外培养的rpe细胞中egf表达的影响,应用免疫细胞化学染色方法检测兔rpe细胞中egf的表达情况,寻找姜黄素抑制egf表达的最佳浓度;应用rt-pcr法、westernblot法检测姜黄素对兔rpe细胞中egfmrna和蛋白表达的影响,探讨姜黄素抑制egf的作用机制。方法:选取生长状态良好的兔第3代rpe细胞在盖玻片上制备成细胞爬片进行实验。分为空白对照组（含0.5‰dmso的10%fbs.dmem）和10、15、20ug/ml姜黄素4组;每组各设6个复孔,共接种3块培养板,加药后24、48、72h时随机抽取1块培养板行免疫组织化学染色,观察rpe细胞内egf的表达情况。rt-pcr、westernblot分别检测空白对照组（含0.5‰dmso的10%fbs.dmem）、姜黄素（15ug/ml）、egf（9ng/ml含0.5‰dmso）、egf（9ng/ml）+姜黄素（15ug/ml）作用24、48、72h后rpe细胞中egfmrna和蛋白表达的影响。结果:1不同浓度姜黄素对rpe内egf表达的抑制作用:时间依赖性:姜黄素各浓度组对rpe细胞内egf表达的抑制作用均随作用时间的延长而增强,各时间点之间差异均有统计学意义（p<0.05）,姜黄素对rpe细胞内egf表达的抑制作用具有时间依赖性。剂量依赖性:姜黄素各时间点对rpe细胞内egf表达的抑制均随药物质量浓度的增高而增强,除姜黄素15ug/ml和20ug/ml组之间差异无统计学意义（p>0.05）外,其余各质量浓度之间差异均有统计学意义（p<0.05）。2姜黄素对rpe细胞内egfmrna转录的影响:向培养液中加入姜黄素使其浓度为15ug/ml,在24h、48h、及72h检测egf的mrna含量,可见随时间延长细胞内egf的mrna表达量下降,和对照组相比较,差异有统计学意义（p<0.05）;不同时间点间做比较,相邻时间点组间相比差异均有统计学意义（p<0.05）。姜黄素对egf作用下rpe细胞中egfmrna表达量在各时间点和对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）,不同时间点间,相邻的时间组相比较差异均有统计学意义（p<0.05）。3姜黄素对rpe细胞内egf蛋白表达的影响:向培养液中加入姜黄素使其浓度为15ug/ml,作用24h、48h、及72h,随着时间的延长细胞内egf蛋白表达量逐渐下降,与对照组相比较差异有统计学意义（p<0.05）;不同时间点间,相邻的时间组间相比较差异均有统计学意义（p<0.05）。姜黄素对egf作用下rpe细胞中egf蛋白表达量在各时间点和对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）,不同时间点间,相邻的时间组相比差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:姜黄素在体外抑制兔rpe细胞内egf的表达,最佳抑制浓度是15ug/ml,姜黄素在体外可显着抑制兔rpe细胞内egfmrna和蛋白的表达。第三部分姜黄素在兔眼增殖性玻璃体视网膜病变中对egf作用的实验研究目的:研究姜黄素在体内兔眼增殖性玻璃体视网膜病变形成过程中对egf的作用及对pvr的防治作用。方法:选择正常青紫蓝兔30只,所有兔在玻璃体注射前均抽出0.2ml玻璃体,随机选取一眼纳入对照组:共30眼,玻璃体腔注射0.1ml（2×106）培养的生长状态良好的第三代同种rpe细胞和含0.5‰dmso的生理盐水0.1ml;另一眼纳入实验组:共30眼,玻璃体腔注射0.1ml（2×106）培养的生长状态良好的同种第三代rpe细胞和质量浓度为1mg/ml的姜黄素0.1ml。注射后3、7、14、21、28天进行裂隙灯显微镜检查观察眼前节和前部玻璃体情况,间接眼底镜检查观察眼底情况,眼底彩色照相,眼部b超检查观察玻璃体浑浊情况和视网膜有无脱离及脱离的程度,检查完毕后,在每个时间点随机抽取6只兔,12只眼,对照组6只眼,实验组6只眼,分别抽取玻璃体,采用兔表皮生长因子elisa试剂盒检测玻璃体液中egf的含量。结果:1前房反应:玻璃体腔注射后第3天对照组和实验组兔眼前房内均可见少量浮游物,第7天时均消退。2玻璃体和视网膜情况:第3天两组玻璃体均有浑浊,实验组玻璃体混浊轻,第7天时玻璃体内有增殖膜形成,对照组增殖膜多且厚,实验组增殖膜局限且薄;第14天时对照组视网膜脱离发生率（11/18）61%,实验组玻璃体内增殖膜较薄,视网膜脱离发生率（2/18）11%;第21天时对照组视网膜脱离发生率（8/12）67%,增殖膜上可见新生血管,实验组视网膜脱离发生率（2/12）16%,视网膜脱离范围小,第28天对照组视网膜脱离渐加重,并有新生血管生长,视网膜脱离发生率（5/6）83%,实验组视网膜脱离局限,发生率（1/6）16%;视网膜脱离发生率实验组和对照组比较差异显着,有统计学意义（p<0.05）。3玻璃体中egf含量测定（elisa结果）:玻璃体液中egf含量对照组较高,实验组较少,各时间点实验组和对照组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:玻璃体腔内注射姜黄素可以有效抑制RPE细胞诱导的兔眼实验性PVR形成过程中表皮生长因子的水平,进而抑制PVR的发生和发展。
陈臻[7]（2016）在《LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究》文中研究表明研究背景增殖性玻璃体视网膜病变（Proliferative vitreoretinopathy,PVR）是孔源性视网膜脱离（rhegmatogenous retinal detachment,RRD）以及行视网膜复位手术后的一种并发症。PVR的病理变化涉及细胞去极化、迁移、黏附、增殖等一系列细胞活动过程,此外还与分泌胶原等细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的异常有关;经过上述病理过程之后,在视网膜前后表面以及玻璃体中将形成具有收缩能力的增殖膜,由于后者的收缩,从而造成牵拉性视网膜脱离（tractional retinal detachment,TRD）。在近年来的研究中,PVR的发生以及其机制一直是眼底病研究的热点及难点。视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）处于视网膜光感受器细胞层的外围,其结构由一层排列整齐的六角形细胞组成。目前的研究已证实,RPE细胞对PVR的发生和发展至关重要。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）为PVR的发生和发展过程中的重要环节。EMT是指具有上皮样表型的细胞,当其失去极性后活动能力增强,在细胞间质之间能够自由移动并且表现出纤维样表型的转化过程。EMT通常分为三种亚型:其一,是原肠胚形成,机体中原始的上皮细胞通过EMT参与多种细胞的生物胚胎发育及器官的形成中;其二,为内皮或者第二上皮转化为组织成纤维细胞,从而在机体的伤口愈合以及器官的纤维化过程中发挥重要作用;其三,是上皮来源的细胞失去极性,从而转化为具有侵袭能力的细胞。转化生长因子β活化激酶-1（transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1）为MAP3K家族中的主要成员之一,属于色氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其活性受到TGF-β以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）的调控。在生物机体中,TAK1经由P38、JNK以及NF-κB通路活化实现对一系列特异性细胞转录因子的调控,从而影响细胞的生存、分化等生理病理过程,同时还对炎症反应具有调控作用。由于tak1功能具有多样性,因此tak1在炎症性疾病中成为了主要的靶激酶。除此之外,tak1还参与了mkk3/4-p38/jnk-ap-1以及ikk-nf-κb等重要信号转导通路的活化,对细胞的存活、分化以及炎症应答具有十分重要的调控作用。转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,tgf-β）为一类新发现的具有对细胞分化和生长起调节作用的多功能细胞因子,大量研究证实,tgf-β是目前已知的具有促进组织纤维化的最重要的细胞因子,其在肾纤维化、肝纤维化和肺纤维化的患者血液中高表达。研究表明,tgf-β在pvr的发生和发展过程中发挥了重要作用,但其具体作用和机制并不十分清楚,尚需进一步深入研究。目的本课题旨在明确:1.tak1在tgf-β1诱导的人rpe细胞间质化过程中的作用;2.探讨tak1抑制剂lytak1对rpe细胞间质化的作用;3.研究lytak1对rpe细胞间质化的作用机制,旨在为pvr的治疗奠定实验基础。方法1.采用elisa法检测2014年6月2014年12月期间在云南省第一人民医院眼科30例pvr患者、20例imh患者以及同期15例正常志愿者,分别检测玻璃体液和/或外周血中tgf-β1和tak1的表达水平。所有患者的年龄均在4565岁之间。其中,pvr患者中有男性为18例,女性为12例;imh患者中男性为8例,女性为12例;健康志愿者中男性为9例,女性为6例。2.将0.01ng/mltgf-β1作用于人rpe细胞株arpe-19,培养24h后采用荧光定量pcr法检测细胞中tak1mrna的表达;分别用不同浓度的lytak1（0μm、1μm、10μm、25μm、50μm）作用于0.01ng/mltgf-β1诱导后的arpe-19细胞,westernblot法检测细胞中tak1蛋白的表达;transwell小室法检测细胞的侵袭能力;流式细胞术（annexinv-fitc/pi双染色法）检测细胞的凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。3.采用荧光定量pcr法分别检测对照组、tgf-β1+dmso组以及tgf-β1+lytak1组arpe-19细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-sma）和纤维粘连蛋白（fibronectin）mrna的表达。采用westernblot法分别检测对照组、tgf-β1+dmso组以及tgf-β1+lytak1各浓度组（0μm、1μm、10μm、25μm、50μm）arpe-19细胞中a-sma、fibronectin、p-smad2、p-smad3、ikkα、nf-κbp65蛋白的表达。结果1.pvr和imh两组间tak1的浓度存在显着差异（t=3.114,p=0.035<0.05）,即pvr患者玻璃体中tak1的浓度显着高于imh组;对pvr和正常组两组的间血清tak1浓度是否存在差异性进行比较分析,结果表明两组间tak1的浓度存在显着差异（t=3.156,p=0.034<0.05）,即pvr患者血清中tak1的浓度显着高于imh组。上述结果表明,pvr患者玻璃体以及血清中tak1的含量均显着高于imh患者,血清中的tak1含量也明显高于健康人群,提示其可能对pvr的发生以及发展过程具有促进作用。pvr患者、imh患者以及健康志愿者的玻璃体液和/或血清中tgf-β1的浓度存在显着差异（t=2.319,p=0.033<0.05）,即pvr患者玻璃体中tgf-β1的浓度显着高于imh组。对pvr和正常组两组间的血清tgf-β1浓度是否存在差异性采用t检验进行比较分析,结果表明两组间tgf-β1的浓度存在显着差异（t=3.312,p=0.037<0.05）,即pvr患者血清中tgf-β1的浓度显着高于imh组。上述结果表明,pvr患者玻璃体和/或血清中tgf-β1的含量均显着高于imh患者以及健康人群,提示其与pvr的发生以及发展过程有关。2.荧光定量pcr检测结果表明,tgf-β1处理组arpe-19细胞中tak1mrna的表达显着高于对照组,tgf-β1能够明显增高tak1蛋白的表达,而当用不同浓度的lytak1作用细胞后,细胞中tak1蛋白的表达量均发生不同程度的降低（p<0.05）,其中当lytak1的浓度为25μm时tak1蛋白的表达量最低。cck-8检测表明,当lytak1作用24h时,各浓度组细胞的增殖活性均未见显着变化（p>0.05）;而当lytak1作用48h以及72h之后,随着lytak1作用浓度的增加,当lytak1作用浓度为50μm时对arpe-19细胞的增殖活性的抑制率最高。arpe-19细胞的增殖活性逐渐降低,表明lytak1对arpe-19细胞的活性呈剂量依赖性。transwell小室法检测结果表明,lytak1各浓度组与对照组相比视野平均侵袭细胞数量显着减少,且随着lytak1浓度的增高其侵袭细胞数量逐渐降低,提示lytak1对arpe-19细胞的侵袭具有抑制作用,且呈剂量依赖性。流式细胞术检测结果表明,随着lytak1作用浓度的升高,arpe-19细胞的凋亡率也随着上升,提示lytak1诱导arpe-19细胞凋亡呈现一定的剂量依赖性。细胞划痕实验结果表明,48 h后各浓度LYTAK1作用组ARPE-19细胞的迁移距离较对照组明显缩短（P<0.05）;且随着LYTAK1浓度的增高,细胞的迁移距离逐渐降低,提示LYTAK1抑制ARPE-19细胞迁移呈现一定的剂量依赖性。3.与对照组相比,TGF-β1+DMSO组以及TGF-β1+LYTAK1组中a-SMA和fibronectin mRNA的表达均明显增高;而相较于TGF-β1+DMSO组,TGF-β1+LYTAK1组中a-SMA和fibronectin mRNA的表达量显着降低。Western blot法检测结果表明,TGF-β1+DMSO组细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达均显着高于对照组。TGF-β1+LYTAK1各浓度组细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达随LYTAK1浓度的增高而逐渐降低,呈剂量依赖性,而LYTAK1对p-Smad3蛋白的表达无显着影响。结论1.PVR患者血清以及玻璃体中TAK1和TGF-β1的表达量显着增高,其表达上调可能与PVR的发生和发展有关。2.TGF-β1能够显着上调ARPE-19细胞中TAK1的表达;3.LYTAK1能够明显抑制ARPE-19细胞中TAK1的表达,且呈剂量依赖性;4.TGF-β1能够通过上调ARPE-19细胞中TAK1、a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65的表达,促进EMT的发生和发展;而LYTAK1能够通过抑制TAK1、a-SMA、fibronectin、p-Smad2、IKKα、NF-κBp65的表达发挥抑制EMT的发生和发展。5.LYTAK1能够明显抑制ARPE-19细胞的增殖活性、细胞凋亡、侵袭及迁移,且呈剂量依赖性。
田润[8]（2009）在《血小板反应蛋白-1在缺氧人视网膜色素上皮细胞中的表达及VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞的影响》文中提出第一章缺氧对ARPE-19细胞表达TGF-β2、VEGF、PEDF及TSP-1的影响目的:探讨缺氧诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）细胞株（ARPE-19）表达转化生长因子—β2（transforming growthfactor-β2,TGF-β2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）及血小板反应蛋白—1（Thrombospondin-1 TSP-1）的情况。方法:含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养ARPE-19细胞,加入150umol/mlCoCl2进行化学缺氧,细胞免疫荧光染色及WesternBlot技术检测ARPE-19细胞在缺氧0h、4h、8h、12h、24h、48h,TGF-β2、VEGF、PEDF及TSP-1的表达情况。结果:1.细胞免疫荧光染色ARPE-19细胞胞浆表达VEGF蛋白,随缺氧时间的延长表达增强,以缺氧24小时最为显着;ARPE-19细胞胞浆表达PEDF蛋白,随缺氧时间的延长表达减弱;ARPE-19细胞胞浆、胞膜、核膜及核仁均有TSP-1及TGF-β2蛋白的表达,随缺氧时间的延长表达减弱。2.Western Blot技术检测ARPE-19细胞缺氧组表达VEGF随时间延长表达较常氧对照组明显增加,以24小时达高峰,缺氧组为常氧组的2.6倍,此后有所下降,缺氧与常氧组除0小时外（P=0.935）,其它各时间点差异均有统计学意义（P=0.000-0.002）;表达PEDF、TSP-1及TGF-β2缺氧组较常氧对照组明显减少,48小时缺氧组分别为常氧组的0.30倍、0.35倍及0.28倍,缺氧与常氧组除0小时外（P=0.125）、（P=0.803）、（P=0.086）,其它各时间点差异均有统计学意义（P=0.000-0.014）、（P=0.000-0.003）、（P=0.000-0.001）。3.缺氧不同作用时间APRE-19表达PEDF、TGF-β2与TSP-1成正相关（r=0.902,P=0.000）、（r=0.990,P=0.000）;缺氧不同作用时间APRE-19表达VEGF与TSP-1成负相关（r=-0.853,P=0.000）。结论:1.缺氧启动血管新生可能通过ARPE-19细胞表达促血管生成因子VEGF的增加及抗血管生成因子PEDF、TSP-1及TGF-β2的减少实现。2.TSP-1不同于作为血管生成正向作用因子的VEGF,可能与PEDF及TGF-β2一同作为血管生成的负向作用因子参与血管新生性疾病的发生发展。第二章VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮（RF/6A）细胞的作用目的:探讨VR-10合成多肽对猴脉络膜视网膜内皮细胞株（RF/6A细胞）增生、移行的作用及对TGF-β2、VEGF、PEDF表达的影响。方法:MTT法检测1μg/ml外源性TSP-1及0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml的VR-10合成多肽在作用6、12、24、48小时后对RF/6A细胞增殖的影响;Transwell小室实验检测作用24小时后对细胞移行的影响;细胞免疫荧光染色及RT-PCR技术检测对RF/6A细胞表达TGF-β2、VEGF、PEDF的影响。结果:1.MTT法检测不同浓度和时间TSP-1及VR-10合成多肽作用RF/6A细胞存活率:TSP-1及VR-10合成多肽对RF/6A细胞均有抑制作用,且随作用时间及浓度的增加,细胞存活率越低。以作用48小时VR-10合成多肽10μg/ml组细胞存活率最低为78%（P＜0.001）。2.Transwell小室实验中TSP-1及VR-10合成多肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用（P＜0.001）;以10μg/ml的VR-10合成多肽抑制率最高,1μg/ml TSP-1全肽抑制率次之。VR-10合成多肽随浓度增加抑制率越高（P＜0.001）;0.1μug/ml的VR-10合成多肽与1μg/ml的VR-10合成多肽对RF/6A细胞的抑制率差异无明显统计学意义（P=0.114）。3.细胞免疫荧光染色RF/6A细胞胞浆表达TGF-β2蛋白,1μg/mlTSP-1处理RF/6A细胞表达TGF-β2较空白对照组强,各浓度VR-10合成多肽处理RF/6A细胞表达TGF-β2与空白对照组比较无明显差别;RF/6A细胞胞浆表达PEDF蛋白,TSP-1及VR-10合成多肽处理RF/6A细胞表达PEDF均较空白对照组表达增强,以10μg/ml浓度组VR-10合成多肽作用最强;RF/6A细胞胞浆表达VEGF蛋白,TSP-1及VR-10合成多肽处理RF/6A细胞表达VEGF均较空白对照组表达减弱,以10μug/ml浓度组VR-10合成多肽作用最强。4、RT-PCR检测除1μg/ml浓度TSP-1组处理RF/6A细胞表达TGF-β2 mRNA较空白对照组表达增强外（P=0.000）,其余各组均与空白对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）;PEDF mRNA均较空白对照组表达增强,以10μg/ml浓度组VR-10合成多肽作用最强（P＜0.001）,各组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）:VEGF mRNA均较空白对照组表达减弱,以10ug/ml浓度组VR-10合成多肽作用最强（P＜0.001）,除1μg/ml浓度组VR-10合成多肽与1μg/mlTSP-1多肽组间比较差异无统计学意义外（P=0.615）,其余各组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。结论:1.VR-10合成多肽具有抑制内皮细胞增殖、移行的作用。2.VR-10合成多肽通过上调抗血管生成因子PEDF,下调促血管生成因子VEGF的表达,及TGF-β2非依赖机制,共同作用而抑制血管新生。第三章VR-10合成多肽对RF/6A细胞表达Fas/FasL、Caspase-3及Bcl-2的影响目的:探讨VR-10合成多肽对RF/6A细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:RT-PCR技术检测10μg/ml的VR-10合成多肽及空白对照组对RF/6A细胞表达Bcl-2及FasL mRNA的影响。Western Blot技术检测10μg/ml的VR-10合成多肽及空白对照组对RF/6A细胞表达Fas及Caspase-3蛋白的影响。结果:1.RT-PCR检测RF/6A细胞表达Bcl-2 mRNA,10μg/mlVR-10合成多肽处理组较空白对照组表达减少（P=0.000）,RF/6A细胞表达FasL mRNA,10μg/mlVR-10合成多肽处理组较空白对照组表达增强（P=0.001）。2.WB检测空白对照组RF/6A细胞表达Caspase-3蛋白大多为无活性酶原形式（32KD）;10μg/ml VR-10合成多肽处理RF/6A细胞主要表达Caspase-3活性小分子片段（20KD）;10μg/ml VR-10合成多肽处理RF/6A细胞表达Fas蛋白较空白对照组增加（P=0.000）。结论:VR-10合成多肽通过增加凋亡促进基因Fas/FasL而活化Caspase-3,同时伴有生存基因Bcl-2的减少,共同作用介导内皮细胞凋亡。
朱瑞虎,陈辉[9]（2008）在《色素上皮衍生因子与增生性视网膜疾病》文中认为色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）能影响视网膜分化、发育和成熟,对视网膜缺血性损伤有促进修复作用,是新生血管的天然抑制剂。现将PEDF在一些增生性视网膜疾病中的作用作一综述。
刘娉[10]（2007）在《复明片抑制兔视网膜脱离后细胞增殖和促进视功能恢复及其机理研究》文中提出目的：探讨复明片抑制兔视网膜脱离后细胞增殖、促进视功能恢复的作用及其机理。方法：将96只成年健康有色家兔随机分为正常对照组、模型对照组、西药对照组、复明片治疗组。采用视网膜脱离动物模型,在造模前1天、造模后当天、6天、13天及20天5个时相,行各兔术眼眼底、B超、眼底照相、视网膜电图检查观察各组视网膜复位情况及屈光间质质情况,在造模后7天、14天及21天三个时相,取脱离及复位视网膜组织行常规病理学HE染色及电镜检查视网膜组织形态结构及超微结构,用放射免疫方法分析玻璃体腔中IL-6.ET-1表达,由免疫组织化学方法观察视网膜组织中IL-1β、MMP-2的表达情况,采用流式细胞仪检测视网膜组织中PCNA阳性细胞表达情况。结果：复明片能促进兔脱离视网膜复位,减轻脱离及复位视网膜组织及细胞的形态学损伤,降低IL-6、ET-1的含量,下调视网膜组织中IL-1β、MMP-2、PCNA的表达,从而抑制增殖,改善视功能。结论：复明片通过抑制兔视网膜脱离后的细胞增殖、炎症反应及基质降解而起到保护视网膜组织结构、促进视网膜脱离后视功能恢复的作用。
二、人玻璃体液对培养的视网膜色素上皮细胞形态及骨架蛋白表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人玻璃体液对培养的视网膜色素上皮细胞形态及骨架蛋白表达的影响（论文提纲范文）
（1）外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变中的治疗作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、外伤性视神经病变模型的构建与探究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 1.1.2 实验试剂、耗材 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠视神经钳夹伤模型的建立 |
| 1.2.2 不同损伤冲量下RNFL厚度的体内分析 |
| 1.2.3 不同损伤冲量下RNFL密度的体外分析 |
| 1.2.4 不同损伤冲量下RGC数目的存活 |
| 1.2.5 不同损伤冲量下RNFL与RGC的联系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变治疗中的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 2.1.2 实验试剂、耗材 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 构建并筛选高效负载神经肽PACAP38的“外泌体-肽”系统 |
| 2.2.2 EXO_(RGC)-PACAP38系统在TON治疗中的研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 外伤性视神经损伤与治疗的研究现状 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的蛋白质组学分析以及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 前言外伤性PVR的临床研究与基础研究概况 |
| 1.1 外伤性PVR简介 |
| 1.2 外伤性PVR的生物学基础与潜在治疗药物 |
| 1.3 蛋白质组学在PVR相关研究中应用 |
| 1.4 ABCA4在眼科疾病中的研究现状 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 蛋白质组学筛选外伤性PVR中的差异蛋白与验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 资料与方法 |
| 2.3 实验过程 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 ABCA4在外伤性PVR中的功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 综述 外伤性PVR的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（3）三七防治兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 1.外伤性PVR动物模型的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制方法 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 富含血小板的血浆(PRP)制备 |
| 1.2.3 造模方法 |
| 1.2.4 观察指标及方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 1.4 实验结果与分析 |
| 1.4.1 一般情况 |
| 1.4.2 眼底观察情况 |
| 1.4.3 兔眼球常规组织病理学检测结果 |
| 1.4.4 兔眼底增殖膜截面积检测结果 |
| 第二部分 |
| 2.三七对外伤性PVR兔视网膜中TGF-β及HGF表达的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验药品及相关试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配制方法 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组方法 |
| 2.2.2 富含血小板的血浆制备方法 |
| 2.2.3 兔外伤性PVR模型制作 |
| 2.2.4 给药方式 |
| 2.2.5 标本的采集 |
| 2.2.6 观察指标及方法 |
| 2.2.6.1 眼底观察 |
| 2.2.6.2 兔视网膜常规组织病理学观察 |
| 2.2.6.3 兔视网膜中转化生长因子(TGF-β)表达的观察检测 |
| 2.2.6.4 兔视网膜中肝细胞生长因子(HGF)表达的观察检测 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 一般情况 |
| 2.4.2 眼底观察情况 |
| 2.4.3 兔眼视网膜常规组织病理学检测结果 |
| 2.4.4 兔眼底增殖膜截面积检测结果 |
| 2.4.5 TGF-β的观察测定结果 |
| 2.4.6 HGF的观察测定结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 PVR模型建立方法的研究 |
| 3.1.1 玻璃体腔内注入细胞成分诱发PVR的动物模型 |
| 3.1.2 外伤制成的PVR模型 |
| 3.1.3 眼内植入铁质异物建立外伤性PVR动物模型 |
| 3.1.4 利用眼外伤联合玻璃体腔内注入血液成分建立PVR动物模型 |
| 3.2 阳性药物对照组的选择 |
| 3.3 阳性指标的选择 |
| 3.4 PVR的发病机制研究 |
| 3.4.1 PVR相关细胞学研究 |
| 3.4.2 PVR相关细胞因子研究 |
| 3.4.3 PVR与细胞外基质(ECM) |
| 3.4.4 PVR与基质金属蛋白酶(MMPs)的研究 |
| 3.4.5 PVR的蛋白组学研究 |
| 3.5 中医学对PVR及其治疗的认识 |
| 3.6 三七的药理作用研究及实验用药选择依据 |
| 3.6.1 止血作用 |
| 3.6.2 活血化瘀作用 |
| 3.6.3 抗炎作用 |
| 3.6.4 抗纤维化作用 |
| 3.7 三七对兔外伤性PVR的防治作用及机理 |
| 3.7.1 减轻外伤性PVR兔眼底增生情况 |
| 3.7.2 抑制外伤性PVR兔眼底增殖膜的形成 |
| 3.7.3 抑制外伤性PVR兔视网膜中TGF-β的表达水平 |
| 3.7.4 抑制外伤性PVR兔视网膜中HGF的表达水平 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）新型生物肽抑制眼部纤维化疾病作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 生物信息学方法筛选多肽BP2 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 多肽BP2体内外抑制PVR有效性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 多肽BP2体内外抑制青光眼滤过术后疤痕有效性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 多肽抑制角膜疤痕及皮肤疤痕有效性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 多肽生物安全性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 6 多肽抑制纤维化机制研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 7 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表及获奖情况 |
（5）色素上皮衍生因子对高糖中小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 人玻璃体液色素上皮衍生因子蛋白检测: |
| 1.2 周细胞原代培养: |
| 1.3 周细胞除杂: |
| 1.4实验分组: |
| 1.5 视网膜毛细血管周细胞凋亡检测: |
| 1.6 统计学处理: |
| 2 结果 |
| 2.1 人玻璃体液糖浓度与周细胞凋亡的关系: |
| 2.2 小鼠视网膜周细胞形态观察: |
| 2.3 小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡: |
| 2.4 小鼠周细胞凋亡与糖浓度的关系: |
| 2.5 外源性PEDF对周细胞凋亡的影响: |
| 3 讨论 |
（6）姜黄素在增殖性玻璃体视网膜病变中对表皮生长因子的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 表皮生长因子对体外培养的RPE细胞的作用及其在RPE细胞内的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 姜黄素对体外培养的RPE细胞中EGF表达的抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 姜黄素在防治兔眼增殖性玻璃体视网膜病变中对EGF作用的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 增殖性玻璃体视网膜病变的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 TAK1和TGF-β1 在PVR患者玻璃体液以及血清中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 LYTAK1对TGF-β1 诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖和移行的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 LYTAK1抑制TGF-β1 诱导的人视网膜色素上皮细胞间质化机制的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 在读期间发表文章 |
（8）血小板反应蛋白-1在缺氧人视网膜色素上皮细胞中的表达及VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词一览表 |
| 前言 |
| 第一章 缺氧对ARPE-19细胞表达TGF-β2、VEGF、PEDF及TSP-1的影响 |
| 1.1 实验对象、试剂和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 VR-10对恒河猴脉络膜视网膜内皮(RF/6A)细胞的作用 |
| 2.1 实验对象、试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 VR-10合成多肽对RF/6A细胞表达Fas/FasL、Caspase-3及Bcl-2的影响 |
| 3.1 实验对象、试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 总结 |
| 附图 |
| 综述 血小板反应蛋白(thrombospondin,TSP)在眼部的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及奖励 |
（10）复明片抑制兔视网膜脱离后细胞增殖和促进视功能恢复及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器及器械 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 视网膜脱离模型的建立 |
| 2.3 给药方法 |
| 3 观察指标及检测方法 |
| 3.1 眼底观察、B超检查、眼底照相 |
| 3.2 HE染色病理形态学观察 |
| 3.3 超微结构观察 |
| 3.4 视网膜电图检查 |
| 3.5 细胞悬液制备方法及流式细胞检测PCNA表达 |
| 3.6 玻璃体腔液提取方法及放射免疫分析IL-6的表达 |
| 3.7 玻璃体腔液提取方法及放射免疫分析ET-1的表达 |
| 3.8 免疫组化观察 |
| 4 统计学处理 |
| 结果与分析 |
| 1 眼底观察与B超检查 |
| 2 复明片对视网膜组织HE染色病理形态学的影响 |
| 2.1 术后7天HE染色病理形态学 |
| 2.2 术后14天HE染色病理形态学 |
| 2.3 术后21天HE染色病理形态学 |
| 3 复明片对视网膜组织超微结构的影响 |
| 3.1 术后7天超微结构 |
| 3.2 术后14天超微结构 |
| 3.3 术后21天超微结构 |
| 4 复明片对ERG结果的影响 |
| 5 复明片对PCNA阳性细胞表达的影响 |
| 6 复明片对玻璃体腔液IL-6表达的影响 |
| 7 复明片对玻璃体腔液ET-1表达的的影响 |
| 8 复明片对IL-1表达的影响 |
| 8.1 术后第7天 |
| 8.2 术后第14天 |
| 8.3 术后第21天 |
| 9 复明片对MMP-2表达的影响 |
| 9.1 术后第7天 |
| 9.2 术后第14天 |
| 9.3 术后第21天 |
| 讨论 |
| 1 视网膜脱离动物模型的评价 |
| 2 现代医学对药物促进视网膜脱离复位后视功能恢复的研究 |
| 3 复明片的立法组方依据及分析 |
| 3.1 祖国医学对视网膜脱离的认识及研究现状 |
| 3.2 导师对本病的认识及前期研究 |
| 3.3 复明片组方及现代药理学研究 |
| 4 复明片对视网膜脱离后视功能恢复的作用 |
| 5 复明片促进视网膜脱离后视功能恢复作用机理 |
| 5.1 复明片促进脱离视网膜复位 |
| 5.2 复明片减轻脱离及复位视网膜组织形态学损伤 |
| 5.3 复明片改善视网膜脱离后视网膜能量代谢 |
| 5.4 复明片抑制视网膜脱离后细胞凋亡 |
| 5.5 复明片抑制视网膜色素上皮细胞迁移和增殖 |
| 5.6 复明片下调玻璃体腔IL-6、ET-1表达 |
| 5.7 复明片下调PCNA、IL-1、MMP-2表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 (附图) |
四、人玻璃体液对培养的视网膜色素上皮细胞形态及骨架蛋白表达的影响（论文参考文献）
- [1]外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变中的治疗作用研究[D]. 王甜. 天津医科大学, 2020(06)
- [2]外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的蛋白质组学分析以及分子机制研究[D]. 王梦华. 郑州大学, 2018(12)
- [3]三七防治兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究[D]. 余丰. 成都中医药大学, 2018(02)
- [4]新型生物肽抑制眼部纤维化疾病作用及机制研究[D]. 朱邵品. 上海交通大学, 2017(05)
- [5]色素上皮衍生因子对高糖中小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响[J]. 侯佳,王晋芬. 中国药物与临床, 2017(02)
- [6]姜黄素在增殖性玻璃体视网膜病变中对表皮生长因子的作用[D]. 任彦新. 河北医科大学, 2016(08)
- [7]LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究[D]. 陈臻. 重庆医科大学, 2016(02)
- [8]血小板反应蛋白-1在缺氧人视网膜色素上皮细胞中的表达及VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞的影响[D]. 田润. 中南大学, 2009(02)
- [9]色素上皮衍生因子与增生性视网膜疾病[J]. 朱瑞虎,陈辉. 中国实用眼科杂志, 2008(10)
- [10]复明片抑制兔视网膜脱离后细胞增殖和促进视功能恢复及其机理研究[D]. 刘娉. 湖南中医药大学, 2007(S1)