一、猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检测（论文文献综述）
张东辉,党菊霞,许永华,许琴,李建瑛,是文辉,李佳佳,马娜,董翔,卢开伯,龙志新[1]（2012）在《兔骨移植材料组织学特征及体内埋植3个月病理学观察》文中进行了进一步梳理目的观察骨移植材料组织学特征及埋植于兔体内3个月的病理学变化。方法用新鲜兔股骨为原料,制备骨移植材料,观察其形态,组织结构及超微结构。手术制备兔股骨缺损模型,移植制备的骨移植材料,3个月后取材行组织学观察。结果制备的兔骨移植材料颜色浅白,完整无断裂;光镜下,骨移植材料骨陷窝内空虚,未见细胞和其它细胞成分。哈佛氏系统中央管及周围陷窝中均未见细胞,整个基质呈伊红色;扫描电镜观察骨结构较完整,骨陷窝空虚,陷窝内壁光滑规则,未见任何细胞残留成分。埋植3个月后组织学观察显示外层形成纤维软骨,逐渐向内形成软骨,有钙盐沉着,再向内渐变成新生骨,可见到呈扁平状的初级成骨细胞及呈圆形的成熟成骨细胞,未见作为支架的骨移植材料,无炎细胞;扫描电镜观察骨组织表面有大量细胞附着,骨陷窝内也有细胞生长。结论我们制作的骨移植材料有一定的临床应用价值。
钟超[2]（2012）在《去抗原异种松质骨与兔成骨细胞组织相容性的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：观察不同方法制备的猪松质骨材料对异种抗原分布及表达的影响,研究不同方法制备的猪松质骨材料与乳兔来源的成骨细胞在体外复合培养后组织相容性的变化。为异种骨修复骨损关节病的临床应用提供一定的实验依据。方法：分别采用深低温冷冻法、酶消化法和深低温冷冻加酶消化法制备猪松质骨材料。将实验分为A、B、C、D组。A组：新鲜猪骨组、B组：深低温冷冻组、C组：酶消化组、D组：深低温冷冻加酶消化组。分别采用苏木素—伊红染色和免疫组织化学的方法观察各组材料的组织学特征及α-Gal抗原、MHC-Ⅰ抗原和MHC-Ⅱ抗原的性状、分布及表达变化。并将不同方法制备的B、C、D组的猪松质骨材料与兔成骨细胞进行体外复合培养,采用倒置相差显微镜、普通光学显微镜、扫描电镜观察兔成骨细胞在猪松质骨材料中的黏附、生长及增殖特点。结果：苏木素—伊红染色镜下可见新鲜猪骨材料中广泛分布骨陷窝、骨细胞、成骨细胞、大量的脂肪网架结构,内含骨髓细胞。深低温冷冻骨材料中含大量的骨陷窝,含少量的骨细胞、成骨细胞、骨髓细胞及脂肪网架结构。酶消化骨材料中含大量骨陷窝,含极少量的骨细胞、成骨细胞,骨髓腔中未见脂肪网架结构。深低温冷冻加酶消化骨材料中含大量骨陷窝,未见骨细胞、成骨细胞,骨髓腔中未见脂肪网架结构及骨髓细胞。免疫组化镜下可见新鲜猪骨材料中α-Gal抗原、MHC-Ⅰ抗原广泛表达在成骨细胞、骨髓细胞周围,MHC-Ⅱ抗原表达在骨髓细胞周围。深低温冷冻组的骨基质中含少量骨细胞残留,少量的膜蛋白表面有α-Gal抗原、MHC-Ⅰ抗原和MHC-Ⅱ抗原表达。酶消化组中骨陷窝内有少量骨细胞残留,膜蛋白表面含少量MHC-Ⅰ抗原和MHC-Ⅱ抗原表达,未见α-Gal抗原表达。深低温冷冻加酶消化组中未见α-Gal抗原、MHC-Ⅰ抗原和MHC-Ⅱ抗原表达。不同方法制备的猪骨材料与兔成骨细胞体外复合培养后,倒置相差显微镜下可见兔成骨细胞在B、C、D三个组别猪骨材料表面都有生长,扫描电镜下可见深低温冷冻加酶消化的猪骨材料表面有大量的细胞黏附、生长、繁殖并形成网状结构,其细胞外形为星形、多边形、多角形或短梭形,伪足交错呈网状覆盖骨材料孔隙表面。单纯酶消化的骨材料表面成骨细胞呈短梭形并延骨小梁排列,相互融合成网状结构的较少。深低温冷冻的骨材料表面有少量细胞生长、黏附,且细胞生长不充分。结论：深低温冷冻加酶消化可以有效的去除异种抗原,而单纯采用深低温冷冻可以明显的减少异种抗原,但是不能完全的去除异种抗原。单纯采用酶消化法可以明显的减少cc-Gal抗原表达,但MHC-Ⅰ抗原和MHC-Ⅱ抗原不能完全去除。各组猪松质骨材料与兔成骨细胞体外复合培养后观察到深低温冷冻加酶消化制备后的骨材料在组织相容性方面优于单纯的深低温冷冻和单纯的酶消化法制备的骨材料。
杨强,彭江,夏群,马信龙,徐宝山,郭全义,汪爱媛,赵斌,张莉,许文静,卢世璧[3]（2011）在《新型脱细胞骨基质材料的制备及理化评估》文中进行了进一步梳理背景:传统的结构性天然骨脱细胞的方法存在许多不足之处。目的:用新的理化方法对结构性骨块进行脱细胞处理制作新型骨支架材料的可行性,并检测其理化性能。方法:以股骨头负重区结构性骨块为原料,高压水枪冲洗,继而利用Triton-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞等理化处理,制备新型脱细胞骨基质材料,并对支架进行大体、组织学、扫描电镜、Micro-CT观察、生物力学等相关检测。结果与结论:新型脱细胞骨基质材料保留了骨的细胞外基质成分,脱细胞彻底,扫描电镜及Micro-CT观察显示支架具备三维多孔网状结构系统,具有天然骨的孔径和孔隙率;生物力学测试脱细胞组支架的弹性模量为（552.56±58.92）MPa,强度为（11.34±3.49）MPa,与新鲜骨的弹性模量及强度比较,差异无显着性意义（P>0.05）,可作为骨组织工程支架的良好载体。
李康杰[4]（2011）在《脱细胞骨基质联合骨髓间充质干细胞修复动物骨缺损实验研究》文中认为根据统计,在中国每年大约有一千三百二十万人次发生骨折,其中有10-15%无法愈合,另外,每年因为做关节置换手术、外伤、骨骼发育异常,或是其它原因造成的骨科手术高达一百万例,而在这一百万个手术中,约有四十五万个手术是需要接受骨移植的。然而,骨移植的材料来源不论在数量上或是在质量上,却是明显不足的。骨科医师在临床上,经常碰到的问题,就是骨折的处理,一般人发生骨折之后,只要有适当的处理,大多会如期愈合。在正常愈合所需的时间过后,如果尚未愈合,就是延迟愈合。其原因包括骨折碎片间的间隙过大,固定不可靠,骨折碎片的血液供应不足,开放性骨折合并广泛软组织损伤及感染等等。传统上是解除原因,延长愈合时间持续治疗,但仍然不愈合,就是骨折不愈合。治疗骨折不愈合可用物理性刺激,或是使用骨移植手术的方法。临床上,通常骨移植物来源于自体骨移植：即”取”患者自己身上的骨来”种”到需要的部位,如：髂骨、腓骨或肋骨取下的骨头,移植到需要的部位。一般来说,自体骨移植块的效用最佳,且不会发生疾病传播及排斥反应问题,但由于数量有限,且未能提供够强的大块骨移植块,因此应用范围会受限。而异体骨移植,即取自其它人捐赠骨骼进行骨移植,须经过特殊处理（如低温冰冻、冷冻干燥、辐射处理等）,降低其抗原性,以减小排斥现象,并且确定无感染病原后才可使用。但是异体移植骨来源有限,价格昂贵,必须在无菌状态下储存,且保存日期有限,依保存方法而有差异。异体骨移植块的缺点为可能传播肝炎病毒及艾滋病病毒,值得注意。此外,大块异体骨移植块通常会发生骨移植块与宿主骨骼间的融合延缓,以及骨移植块发生吸收或疲乏性骨折等问题。因此,本文研究的重点在于同种异体移植,即将同种骨经过Triton X-100处理后,去除主要的抗原成分,留下矿物质及部分有机成分,作为骨移植块使用。Meezan首先使用化学除垢剂制作了无细胞基底膜,Wilson又首先以Triton X-100为主脱去组织中的所有细胞、抗原、脂质、可溶性蛋白质和可溶性糖胺多糖等物质。其中他采用的除垢剂酶消化方法对狗颈总动脉行脱细胞处理,组织学及电镜观察无细胞成分存在,在基质中主要为胶原和弹性蛋白,结构保存良好。美国Lifecell公司用同样方法制作真皮基质获得了商业性的成功。Dahms对处理的膀胱脱细胞基质成分分析表明了其主要成分为Ⅰ型、Ⅲ型胶原和弹性蛋白。因此,就目前所用的脱细胞处理的方法而言,其基本上保留了促进细胞增殖生长的生物活性成分,为其植入体内修复及再生损伤或缺损的组织提供了物质基础。这样我们有理由相信采用同样方法制备的脱细胞骨基质能够提供渐进式替换作用的骨架,加上自体骨髓间充质干细胞的作用,在体外联合培养后,最终能够修复动物的骨缺损。本研究的主要方法和结果：1、脱细胞骨基质的制备实验联合应用过氧化氢、低渗Tris-Hcl和TritonX-100制备了脱细胞骨基质,之后通过HE染色见新鲜的大鼠松质骨组织切片中可见骨陷窝中含有大量细胞结构,胶原纤维排列整齐；处理组骨陷窝、骨小管中尚有嗜酸性物质残留；处理组标本可见细胞成分基本消失,骨陷窝、骨小管空虚,胶原纤维排列整齐。甲苯胺蓝染色见正常骨松质的骨小梁胶原纤维排列成行,骨细胞占据的骨陷窝分布在骨小梁。骨陷窝中骨细胞核清晰可见,大多数骨陷窝内只有一个骨细胞核。脱细胞骨的细胞外基质胶原纤维排列整齐,染色呈不同程度蓝色,椭圆形骨陷窝内空虚,无骨细胞核及其他结构。2、免疫组化染色免疫组化染色见实验组支架材料的纤维连接蛋白和层粘连蛋白的染色阳性部位在BAECM的骨陷窝周边部,染色较深,呈筛网状、线状分布,为清晰棕色。3、扫描电镜观察扫描电镜可见骨支架是由大量片状骨小梁连接而成的多孔网架,形似海绵状。骨小梁之间的孔隙直径在200-400μm之间,孔间隔厚度为60-100μm。孔隙率为60%,孔洞之间有连联。处理后的骨支架的孔隙内已无骨髓成分。扫描电镜下可见骨小梁上的许多平行排列的骨陷窝,且骨陷窝内已无细胞成分。4、透射电镜观察透射电镜可见脱细胞骨基质的骨陷窝多为低密度影像,有多处空白区,可见少量洗脱残留物质；对照新鲜骨基质的骨陷窝中明显含有细胞成分,并可见细胞核的核仁。免疫组织化学透射电镜可见在脱细胞骨基质的骨陷窝周边弥散存在阳性标记电子密度较高的DAB反应产物呈团块,网状分布,基质可见网状纤维结构,胶原纤维排列整齐。5、洗脱剂残留量测定洗脱剂TritonX-100残留量测定见对照品出峰时间分别为2.495、4.008、4.009min,峰面积948825、1652336、1645545。样品在3min左右无峰值出现。最低检出极限为0.5μl/ml。6、移植免疫分析移植免疫分析在术后4、8周各植入处理组的血清中均可检测出抗体,各时间处理检测组与其相应的无关抗原对照组之间差异非常显着（P<0.01）,说明抗体是针对SD大鼠骨抗原的特异性抗体。统计学分析表明：新鲜骨移植组血清抗体相对OD值最高,与脱细胞骨基质差异非常显着（P<0.01）。淋巴细胞刺激实验中经两种移植物第一次体内致敏后,在体外用SD大鼠脾淋巴细胞二次刺激,新鲜骨移植组的淋巴细胞刺激指数最高,与脱细胞骨基质移植组有显着差异（P<0.01）,植入SD大鼠两种移植物术后8周,再在体外给予相应移植物二次刺激组中,新鲜骨刺激淋巴细胞增殖,而脱细胞骨基质表现为对淋巴细胞增殖的抑制（P<0.01）。7、骨髓间充质干细胞的培养镜下观察见大鼠BMSCs的原代细胞刚接种时呈圆形,多数悬浮于培养液中,可见克隆形成。48h后大部分细胞都贴壁,换液除去未贴壁的细胞后,可见部分贴壁细胞形态不一,呈梭形的成纤维细胞样或多角形改变,核较大,位于细胞中央或边缘。3-4天开始出现散在的贴壁生长的成纤维样的细胞,再过2-3天,细胞呈现克隆样生长的集落,集落细胞增殖迅速,7天左右每个集落约含有100-200个细胞,细胞形态基本为纺锤形的成纤维细胞样,部分呈宽大扁平的多边形,约9-11天时融合成单层,一般能够达到70%-80%的细胞融合状态。8、流式细胞仪鉴定流式细胞仪检测见培养的第3代BMSCs均一表达CD90、CD44、CD106,阳性率分别为90.05%、95.48%、67.22%;而CD34、CD45、CD11b阴性,阳性率分别为1.02%、0.86%、0.32%。9、诱导后的细胞形态观察倒置显微镜下观察可见多数细胞形态发生明显变化,由梭形转化为圆形或方形,且胞体增大,胞核变大变圆,胞浆中可见较多细小黑色颗粒,胞核色较淡,胞浆色较深,胞核与胞浆对比明显。10、诱导后的细胞鉴定茜素红染色见部分细胞成聚集生长,形成矿化结节,茜素红染色显示为橘红色；钙钻法碱性磷酸酶染色显示胞浆中一些细小黑色颗粒为棕黑色；Ⅰ型胶原免疫荧光染色阳性,红色荧光（Cy3）表示Ⅰ型胶原在细胞内的分布,Ⅰ型胶原多在胞浆靠近胞核处,蓝色荧光（DAPI）为细胞核。11、扫描电镜观察联合培养的脱细胞骨基质与诱导后的成骨样细胞联合培养24,48,72h后,扫描电镜观察并未见脱细胞骨基质组和羟基磷灰石组之间的细胞形态有明显差异,细胞在两组材料上均生长良好,且分布均匀,细胞形态大小不一,但在两组材料中均可见大量的球形细胞黏附在材料上面,每个细胞直径在3-10μm之间,在个别部位还可见正在增殖中的细胞克隆,细胞生长状态良好。12、碱性磷酸酶检测随着培养时间的延长,脱细胞骨基质组和羟基磷灰石组的碱性磷酸酶表达活性都呈上升趋势。在浸提液培养12h和24h,两组之间差异无显着性意义（P>0.05）；在培养48h和72h,脱细胞骨基质组和羟基磷灰石组之间差异有显着性意义（P<0.05）。13、复合细胞的天然脱细胞骨支架修复骨缺损实验成功制作大鼠股骨骨缺损模型后,将复合有细胞的脱细胞骨基质支架材料移植在缺损处,术后4周荧光显微镜见对照组羟基磷灰石支架在镜下显现为黑色条影,周边可见发出绿色荧光的新生骨组织,实验组天然脱细胞骨松质已经能够非常完好地与周边新生骨组织融合在一起,荧光显微镜下无法分辨出其间的差别。普通光镜观察见术后4周及8周的对照组羟基磷灰石显示为黑色条带阴影,而脱细胞骨基质支架之间已填满新生的骨组织,骨支架与新生骨组织很好的融合在一起。偶可见炎性细胞浸润；术后8周甲苯胺蓝染色可见对照组羟基磷灰石显示为黑色条带阴影,而对照组和实验组的支架之间都可以见到已形成的骨单位,新生骨组织已经比较成熟。研究结论：1、利用大鼠股骨成功制备了适于同种异体移植的组织工程骨基质；2、利用动物自身的骨髓间充质干细胞成功地诱导为成骨样细胞；3、制备的脱细胞骨基质在体外适于诱导而来的成骨样细胞的生长；4、联合培养的有细胞的脱细胞骨基质能够很好地修复大鼠股骨骨缺损,有望应用于临床骨缺损疾病的治疗。
杨强[5]（2008）在《以软骨细胞外基质为基础构建组织工程软骨以及骨软骨复合体的实验研究》文中认为研究背景:创伤、骨性关节炎等疾病引起的软骨病变或骨软骨联合病变是骨科较为常见的疾患,同时由于关节软骨自我修复能力有限,目前的多种治疗方法,如微骨折术、自体或异体组织（骨膜、软骨膜、骨软骨块）移植等,存在种种缺陷从而限制了其临床应用,并且不能获得满意的治疗效果。应用组织工程技术构建组织工程软骨或骨软骨复合体被认为是目前最有可能解决此难题的技术手段。组织工程包括三大因素:种子细胞、支架材料和信号因子。骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有多向分化潜能,已经被证实能够向骨、软骨等多种组织分化;由于经过脱细胞处理去除了细胞抗原等免疫性物质而保留了大部分细胞外基质,来源于天然细胞外基质的支架材料,如人脱细胞真皮、脱细胞猪小肠黏膜下层、脱细胞猪心瓣膜以及脱细胞猪膀胱等,已经获准临床应用,目前虽然有关软骨脱细胞处理的文献报道,但研究水平仅停留在整块脱细胞或者粉碎成软骨微粒脱细胞的层面上,未见利用天然软骨细胞外基质成功构建出三维多孔网状支架的报道。本研究的目的是以天然软骨细胞外基质材料为基础,研制组织工程软骨支架、组织工程骨软骨双层（双相）支架,并探讨其与骨髓基质干细胞复合构建组织工程软骨以及骨软骨复合体的可行性。在内容上主要包括:（1）利用软骨细胞外基质材料制备软骨组织工程用支架材料,并复合骨髓基质干细胞在体外以及裸鼠皮下异位构建组织工程软骨;（2）利用软骨细胞外基质和脱细胞骨基质制备组织工程用骨软骨双层（双相）支架,并在体外构建组织工程骨软骨复合体;（3）利用骨髓基质干细胞复合骨软骨双层支架修复犬膝关节负重区骨软骨联合缺损,并对其结果进行大体、组织学、生物化学、生物力学、Micro-CT评估。方法:（1）将天然人软骨粉碎,取500nm～5μm软骨微丝,经脱细胞处理后制备为软骨细胞外基质微丝悬液,冷冻冻干法制备得三维多孔支架,采用物理/化学方法交联,得到软骨细胞外基质来源的三维多孔支架（CartilageECM-derived 3-D Porous Scaffold,CEDPS）,对支架材料进行组织学、生化成分定量分析以及理化性能检测。分离培养犬骨髓基质干细胞,评价支架生物相容性和细胞毒性。（2）将软骨细胞外基质微丝与壳聚糖复合,构建出三维多孔组织工程支架,并对其理化性能进行评估。（3）骨髓基质干细胞经含10ng/ml TGF-β1,10ng/ml bFGF,10-7M地塞米松的条件培养基成软骨诱导后,种植到CEDPS支架上,扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行Ⅱ型胶原免疫组织化学分析。（4）BMSCs成软骨诱导后,用PKH26荧光染料标记,构建BMSCs-CEDPS支架复合体,体外培养3d后,植入裸鼠背部皮下,利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,4周后取材,进行组织学检测以及Ⅱ型胶原免疫组织化学与免疫荧光分析。（5）用新型脱细胞方法制备脱细胞骨基质（AcellularBone Matrix,ACBM）,评估其理化特性与生物相容性。（6）分别用软骨细胞外基质与脱细胞骨以及PLGA与脱细胞骨构建两种组织工程骨软骨双层支架:CEDPS/ACBM,PLGA/ACBM,评估其理化性能。（7）利用BMSCs与CEDPS/ACBM双层支架体外构建组织工程骨软骨复合体,并进行大体、电镜、组织学观察。（8）在犬膝关节内外髁高负重区造一直径4.2mm,深6mm的骨软骨缺损,分为诱导BMSCs-CEDPS组（实验组）和单纯CEDPS支架组（对照组）,分别在3,6月取材,从大体,组织学,生物化学及生物力学,Micro-CT等方面进行全面评估。结果:（1）组织学显示CEDPS支架中无软骨细胞碎片残留,,甲苯胺蓝染色、蕃红花“0”、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性;生化定量结果表明支架保留了大部分的细胞外基质成分;Micro-CT与扫描电镜结果显示支架内孔洞相互连通似海绵状,具有良好的孔径和孔隙率;理化性能结果显示支架具有良好的吸水性能,支架的纵向弹性模量与软骨一个数量级,并且具有良好的拉伸性能。倒置显微镜、扫描电镜观察显示细胞在支架上生长良好,细胞毒性实验表明支架对细胞的生长、增殖无影响。（2）软骨细胞外基质与壳聚糖复合支架具有良好的孔径、孔隙率和吸水性,生物力学结果表明复合支架的弹性模量与软骨同一数量级。（3）体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,组织学结果表明蕃红花“0”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,电镜和组织学结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显着,细胞外有大量基质分泌。（4）经诱导的BMSCs与CEDPS支架在裸鼠皮下成功构建了类软骨组织,PKH26荧光示踪以及分子荧光活体成像系统能无创伤评估组织工程化软骨在裸鼠体内的生长情况,结果表明构建的类软骨组织中的细胞来源于接种的BMSCs。（5）新方法制备的脱细胞骨基质材料去细胞彻底,具备良好的微观结构,与同部位的新鲜骨块具有相似的生物力学性能。（6）制备的两种组织工程骨软骨双层（双相）支架:CEDPS/ACBM,PLGA/ACBM,均具有良好的孔径和孔隙率,并且支架的骨、软骨部分结合良好。（7）体外培养的BMSCs与CEDPS/ACBM双层支架复合体,组织学结果表明软骨部分蕃红花“0”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,骨软骨层结合良好。（8）在修复犬膝关节骨软骨缺损的实验中,结果显示两组以纤维软骨或透明软骨对缺损有不同的修复,大体以及组织学评分表明实验组明显优于对照组,生物力学测试表明6月实验组修复软骨的刚度为正常膝关节软骨的70.1%,与生物化学分析结果一致;软骨下骨的刚度达到正常膝关节的74.96%。Micro-CT结果表明实验组与对照组软骨下骨重建不具备明显差异。结论:（1）以天然软骨细胞外基质为材料构建的三维多孔海绵支架,去细胞彻底,保留了软骨细胞外基质的主要成分,具备合适的孔径、孔隙率、吸水性能、生物力学性能以及良好的生物相容性,无细胞毒性,可作为软骨组织工程的支架载体。（2）软骨细胞外基质与壳聚糖复合支架具有良好的孔径、孔隙率、吸水性、生物力学性能,可作为软骨组织工程支架载体的良好选择。（3）CEDPS能为BMSCs成软骨方向诱导分化提供理想的三维立体环境,BMSCs与CEDPS复合能在体外构建类软骨样组织。（4）PKH26荧光示踪与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归。（5）利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织。（6）新方法制备的脱细胞骨基质材料去细胞彻底,具备良好的微观结构,合适的生物力学性能,可作为骨组织工程支架载体的良好选择。（7）制备的两种组织工程骨软骨双层支架:CEDPS/ACBM,PLGA/ACBM,两层结构分别适合骨、软骨生长的不同要求,并且层间结合紧密,可作为构建组织工程骨软骨复合体的支架载体的良好选择。（8）成软骨诱导的BMSCs与CEDPS/ACBM双层支架复合在体外能培养出骨软骨样组织。（9）CEDPS/ACBM双层支架复合成软骨诱导的BMSCs能成功修复犬膝关节负重区骨软骨联合缺损。
袁道英[6]（2008）在《脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损的实验研究》文中提出实验目的:研究脱细胞骨基质（acellular bone matrix ABM）复合富血小板血浆（platelet-rich plasma PRP）修复兔颅骨缺损的可行性;探讨富血小板血浆促进成骨的作用效果及机制。实验方法:雄性新西兰大白兔24只,体重1.5～2.0 kg。在兔颅骨两侧分别建立一个1×0.5cm全层骨缺损区,同时去除该区骨膜,并注意勿伤及硬脑膜。随机选择一侧骨缺损作实验侧,植入复合PRP的ABM;另一侧为对照侧,仅植入ABM。术后第2、4、8、12周分别处死兔6只取材。通过形态学、影像学和组织学检查,观察两组颅骨缺损修复愈合情况;免疫组织化学法测定骨缺损修复区域血管内皮生长因子（Vessel endothelium growth factor VEGF）的表达;应用Lane-sandhu评分标准进行影像学和组织学评分,评价两组骨缺损修复情况;Image-proplus 5.0图像分析软件对各组新生骨量做定量分析及VEGF表达强度的灰度测量。并对上述各组数据进行统计学分析。实验结果:所有实验动物均未发生炎症和排异反应。随着时间的延长,两侧骨缺损都有不同程度的成骨,新生骨量随时间的延长呈逐渐增加的趋势。在12周时,标本HE染色显示实验组ABM颗粒已完全降解,骨髓腔改建完成,板层骨形成,缺损区基本达到骨性愈合;对照组仍有较大的颗粒未降解,缺损中央部位仍有未愈合区域,有骨髓腔形成,少量板层骨出现。影像学、组织学评分,新生骨量定量分析等结果显示,各时间观察点骨缺损的修复情况实验组均优于对照组,数据分析两组差异有显着性,有统计学意义。术后2周,实验组VEGF呈强阳性表达,随后急剧下降,以后趋于平缓。对照组在术后2、4周呈阳性表达,以后平缓下降。两组相比,在第2、4周时差异有显着性（p＜0.05）,有统计学意义。第8、12周时VEGF的表达差异没有显着性。实验结论:1.ABM颗粒复合PRP可用于非承重骨骨缺损的修复。2.ABM是良好的骨移植替代材料。3.PRP具有促进成骨作用,能加速骨缺损的修复。
王德超[7]（2007）在《脱细胞牛松质骨的生物相容性及修复兔桡骨缺损的研究》文中研究说明目的:理想的骨组织工程支架材料应具有良好的生物相容性、生物降解性、多孔性、一定的机械性能和良好的成骨能力,以利于细胞的粘附、生长、增殖和分化。近年来脱细胞基质材料成为生物衍生材料的研究热点。脱细胞骨细胞外基质是提供细胞粘附、增生和分化的基础,也是将生长因子固定于细胞组分上并维持三维空间结构、允许新的组织生成的支撑物,是良好的骨组织工程支架材料。骨髓基质细胞在体外具有容易培养扩增的特点,在特定的诱导条件可向多方向分化。因此它具有很广泛的应用价值,但在骨组织工程方面的应用并不多。我们以骨髓基质细胞为种子细胞,在体外与脱细胞牛松质骨进行联合培养并观察,为组织工程的新型支架材料提供组织学实验依据。我们研究新型骨修复材料脱细胞牛松质骨的生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。观察脱细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞（BMSCs）修复节段性骨缺损的能力即其作为骨组织工程移植替代材料的可行性。方法:1对脱细胞牛骨基质进行急性毒性实验、热源实验、溶血实验、兔肌肉内种植实验和淋巴细胞转化实验研究。2骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs）的分离、培养及成骨诱导鉴定。无菌条件下,取1月龄新西兰大白兔骨髓,缓缓加入到含有5ml有淋巴分离液的10ml离心管中,2000转/分水平离心30分钟,用含20%新生牛血清的低糖DMEM培养基进行吹打,置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养,3日后更换培养液,待原代骨髓基质干细胞增殖贴壁成单层后,传代培养。BMSCs在特定的条件下可定向分化为不同的间充质组织细胞。取第3代部分BMSCs ,加入矿化诱导液（含20%胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50μg/ml维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的L-DMEM培养液）后培养并观察细胞形态,14天后行Von Kossa染色。3在新西兰大白兔双侧桡骨中段制备段状骨缺损模型。将体外培养扩增成骨诱导的兔骨髓基质干细胞,以5×106/ml细胞浓度接种于脱细胞牛松质骨移植材料上,将复合物植入1.0cm骨缺损动物模型处,以单纯材料及空白组作为对照,于术后4、8、12周分别进行大体标本观察、X线片及组织学检查,观察修复骨缺损的能力。结果:1脱细胞牛骨基质无毒性、无热源性、不引起溶血反应,植入兔肌肉后逐渐发生生物降解并被纤维组织取代,淋巴细胞转化试验结果提示脱细胞牛松质骨移植材料不引起免疫排斥反应。2 ABCB-BMSCs复合物植入后12周,大体标本观察、组织学、X线片显示,缺损已完全修复,单纯材料组也基本修复,而空白组骨缺损未修复。结论:1脱细胞牛骨基质具有良好的生物相容性,是较理想的骨支架材料。2 ABCB-BMSCs复合物具有较强的成骨能力,并能作为自体骨移植的一种替代物。
简月奎[8]（2007）在《改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究》文中提出研究背景:由于创伤、骨病或肿瘤引起的大段骨缺损是骨科临床上经常遇到的棘手问题之一,目前常用的方法是植骨术。移植物来源包括自体骨、同种异体骨、异种骨及各种无活性的人工骨等。自体骨移植存在来源有限、取骨处有并发症、二次手术等缺陷;同种异体骨有伦理、传播传染性疾病、免疫排斥及来源亦有限等;异种骨除了伦理、传播疾病之外,作为移植材料最大的障碍是免疫排斥;各种无活力的人工骨只是单纯的人工替代材料,存在降解困难或降解速率与骨生长速率不一致,影响成骨或机体功能。组织工程学的兴起为大段骨缺损的修复带来了新的希望。利用体外细胞培养技术将种子细胞扩增并和可降解的生物材料复合培养构建有生命活力的组织,植入体内修复缺损,重建骨的功能已不再是遥远的梦想。目前自体细胞来源的组织工程骨研究动物实验已取得了骄人的成绩,并已初步试用于临床,取得了一定的成功。然而,支架材料仍是制约组织工程骨大规模临床应用的瓶颈,制备来源丰富、价格低廉、性能优良的支架材料是研究热点之一。近年来国内外虽然有异种骨用于骨组织工程支架材料的许多研究,如Keil骨、Bio-Oss骨等,但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题。基于此,本实验以猪股骨为原料制备异种脱蛋白骨,在制备工艺上作了改进,主要是尽量保留胶原蛋白,去除非胶原蛋白、肽类、脂类及细胞等,在降低抗原性的同时保留力学强度,作了理化性能、生物安全性、细胞相容性及小型动物成骨等检测。并以制备的异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料与山羊自体骨髓间充质干细胞复合,加入成骨性骨诱导因子rhBMP2构建组织工程骨修复山羊胫骨中下段20%节段性缺损,观察成骨能力和免疫排斥反情况,为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床提供实验依据。目的评估改良法制备异种脱蛋白骨（Xenogenic Deprotein Bone,XDPB）作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段骨缺损的能力,并对XDPB的免疫原性,新生骨的数量、质量进行评价,为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床应用提供实验依据。方法（一）异种（猪）脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究:参照改良法制备,将制备的脱蛋白骨放入-80℃超低温冰箱冷冻3月后取出,真空包装,Co60照射后置-20℃保存。计算每块脱蛋白骨的平均质量、大小,扫描电镜观察并测定材料的孔径和孔隙率,氨基酸分析仪检测氨基酸种类和含量,万能生物力学测试仪检测材料的抗压缩、三点抗弯曲等力学指标。部分脱蛋白骨块于术前浸入含rhBMP2浓度为75ng/ml溶液中2h备用。（二）山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测。1.MSCs培养:在山羊髂骨处用骨穿针穿刺抽取约10ml骨髓,分离MSCs,培养、收集细胞。2. MSCs生物学特性观察:活细胞动态观察、倍增时间;3.MSCs定向诱导分化:第二代细胞进行成骨、成脂诱导培养及钙染色、脂肪染色、ALP染色、ALP活性测定和Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色等。（三）异种脱蛋白骨支架材料的细胞相容性研究。1.异种脱蛋白骨支架材料与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养:倒置镜、扫描电镜观察细胞在材料表面、孔隙内附着、生长和增殖情况。2.异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究:山羊24只,分两组,自体骨对照组6只（自体骨）和实验组18只（异种脱蛋白骨）,分别于术后0、3、7、14、28、56天抽外周血,流式细胞仪检测细胞免疫和ILISA检测体液免疫指标。3.在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究:培养山羊MSCs,传至第三代,细胞同步化后加入BrdU培养。观察BrdU标记的MSCs形态,将BrdU标记的MSCs与XDPB复合培养7天后植入山羊自体内,术后4周处取出移植材料检测标记细胞。（四）异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的临床观察:山羊24只,分4组,每组6只,在每只山羊左侧胫骨中下段造成胫骨总长度20%节段性骨缺损,据不同植入材料不同命名为A组（单纯XDPB）、B组（XDPB+自体MSCs）、C组（自体骨）及D组（XDPB+自体MSCs+rhBMP2）,采用半环槽式外固定器固定。术后即时、4、8、12、16、20、24周对各组山羊进行摄X片,24周处死山羊取右侧胫骨进行双能X线（DEXA）、血管化、生物力学和组织学检测。结果（一）异种（猪）脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究:新制备的XDPB块肉眼观呈白色,略带黄色,长条状,质硬脆,见大量蜂窝状孔隙。光镜下见骨块疏松多孔,孔隙较规则,孔中残留物少。扫描电镜该材料具有原始骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统,具有天然的网孔结构,平均孔径（386.55±25.64）μm,孔隙率（75.33±2.35）%。氨基酸分析胶原类氨基酸（Gly、Arg、Lys）波峰较高,芳香簇氨基酸酪氨酸（Tyr）和半胱氨酸（Cys）波峰消失。力学检测除弹性模量升高外,抗压缩、三点抗弯曲破坏载荷及破坏极限载荷与新鲜骨差异无统计学意义。（二）山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测:1.MSCs培养:原代MSCs接种后1～2天开始贴壁,5～6天形成集落,12～14天长成单层,绝大部分细胞呈梭形,形态均一,分布不均。传代细胞2～4小时完成贴壁,5～6天铺满瓶底,形态更加单一,均匀分布,排列成有规则的方向性。细胞数量在第3天明显增加,第6天达峰,倍增时间为35.5小时。2. MSCs鉴定:成骨诱导培养10～12天形成圆形或卵圆形钙化结节,ALP染色染成灰黑色,核固红染色呈红色结节状,Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色细胞浆内有大量黄色颗粒。成脂诱导培养10～12天出现圆形脂肪小滴,油红O染色呈桔黄色脂肪滴。（三）异种脱蛋白骨支架材料的相容性研究。1.异种脱蛋白骨支架材料的与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养:倒置镜、扫描电镜观察显示山羊MSCs在材料孔隙内生长、分化增殖,在相同时间点细胞增殖测定显示细胞增殖峰值、细胞数量与单纯培养组差异无统计学意义（P>0.05）。2.异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究:异种脱蛋白骨植入组细胞免疫指标在术后3天和7天有轻度升高,14天以后逐渐下降,自体骨组无明显变化,在同一时间点统计学分析两组差异无统计学意义（P>0.05）。体液免疫指标术后无明显变化。3.在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究: XDPB复合BrdU标记的山羊自体MSCs植入术后4周,免疫荧光检测可见BrdU标记细胞在XDPB网孔内生长增殖。（四）异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的动物实验研究:异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损:术后1～15周,空白对照组骨缺损处无骨形成,随时间延长出现骨端硬化,髓腔闭合。术后1～24周,实验组表现为:在同一时间点, X线、骨密度、生物力学、血管化水平和组织学,C组>D组>B组>A组,D组与C组比较差异无统计学意义（P>0.05）,A、B组与C、D组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.本改良法制备的XDPB支架不引起明显细胞和体液免疫反应,有良好的相容性;2.通过BrdU细胞标记技术显示,自体MSCs在DPHP内良好存活、生长并成骨;3.改良法制备异种脱蛋白骨能够作为组织工程支架修复山羊胫骨大段骨缺损;4.本法制备的异种脱蛋白骨的免疫原性低,不影响自体MSCs成骨,若再结合rhBMP2,其成骨能力与自体骨相当。5.单纯XDPB修复骨缺损能力最差,B组其次,复合自体MSCs和rhBMP2组成骨能力和自体骨相当。
冯卫[9]（2007）在《猪异种骨移植靶抗原分布及除抗原处理的研究》文中指出目的：（1）探讨猪骨组织靶抗原分布特点。（2）观察脱脂部分脱蛋白、超深低温冷冻、超深低温冷冻＋酶消化对猪骨组织抗原表达的影响，并研究其性状和生物力学特性改变。（3）研究不同方法处理的猪骨材料与兔成骨细胞组织相容性的变化。（4）不同方法处理的猪骨材料植入兔体内，观察宿主免疫排斥反应和移植骨的转归。方法：（1）采用免疫组化的方法观察α-Gal抗原、MHC-Ⅰ抗原和MHC-Ⅱ抗原在猪骨中的分布情况。（2）观察不同方法处理的猪骨材料的异种抗原及性状改变：实验分为A、B、C、D组。A组：脱脂部分脱蛋白组；B组：超深低温冷冻组；C组：超深低温冷冻＋酶消化组；D组：新鲜猪骨移植组。免疫组化方法观察各组骨材料异种抗原的变化情况，大体观察不同组骨材料的形貌特征结构，扫描电镜观察各组材料的细微结构变化，比较各组骨材料的孔径大小和孔隙率；生物力学实验测定各组骨材料的力学性能变化。（3）不同方法处理的异种骨材料的细胞相容性：将A、B、C组骨材料体外分别与兔成骨细胞联合培养，每块材料上加入浓度为1×107╱ml的细胞悬液20μl，连续培养7天。分别于1、3、5、7天采用MTT法，检测兔成骨细胞在各组骨材料上的增殖情况，倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在骨材料上的粘附生长，流式细胞仪分析细胞周期的变化。（4）不同方法处理的异种骨材料体内移植免疫研究：实验分为A、B、C、D、E、F组，A组：脱脂部分脱蛋白组；B组：超深低温冷冻组；C组：超深低温冷冻＋酶消化组；D组：新鲜异种骨移植组；E组：自体骨移植组；F组：对照组（假手术组）。将各组骨材料分别植入新西兰大白兔双侧骶棘肌内，分别于术后1、2、4周取兔耳缘静脉血，流式细胞仪检测各组外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群和CD4+／CD8+比值的变化；ELISA定量检测各组术后1、2、4、6周血清中IL-2和IL-4水平的变化；组织病理学观察移植骨材料周围炎性细胞浸润情况。（5）不同方法处理的异种骨材料修复兔桡骨缺损的研究：实验分组同（4），将各组骨材料分别植入兔桡骨缺损处，分别于术后6、12、24周取材，X线片检查，根据Lane-Sandhux的X线评分标准，定量观察各组骨缺损的修复情况；组织切片行HE和Masson染色，显微镜下观察各组骨愈合和新骨形成情况。结果：（1）免疫组化研究发现正常猪骨中，α-Gal、MHC-Ⅰ抗原广泛表达在骨髓细胞和骨细胞、成骨细胞胞膜及哈佛氏管周围，MHC-Ⅱ抗原主要表达于骨髓细胞。（2）不同方法处理的猪骨材料的异种抗原及性状改变：①各组抗原表达的比较，A组无骨细胞存留，无抗原阳性表达；B组骨陷窝和Harversian管周围仍有骨细胞存留，骨细胞表面可见少量α-Gal抗原、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原的阳性表达；C组可见骨陷窝内残存蓝染细胞核，无异种抗原的阳性表达；D组骨髓及骨细胞表面大量α-Gal抗原、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原的阳性表达。②扫描电镜观察，各组骨材料孔径大小比较A组＞C组＞B组＞D组，B、D组间比较无统计学差异（P＞0．05），其余各组间比较均有差异（P＜0．05）；材料孔隙率比较A组＞C组＞B组＞D组，其中A组与C组、B组与D组之间比较无明显差别（P＞0．05），其余各组间差别明显（P＜0．05）。③轴向压缩实验，最大载荷比较D组＞C组＞B组＞A组，其中A组明显小于其他各组（P＜0．05），而B、C、D组间无明显差别（P＞0．05）。（3）不同方法处理的异种骨材料的细胞相容性：兔成骨细胞在各组猪骨材料表面上均有生长，并且在第5天后成骨细胞增殖达到高峰，扫描电镜观察和MTT检测结果显示，各组生物相容性能C组＞A组＞B组。流式细胞术检测A、C组骨材料表面成骨细胞的细胞周期之间无明显差异，这两组细胞的S期＋G2／M期明显高于B组（P＜0．05）。（4）不同方法处理的异种骨材料体内移植免疫研究：各组术后1-2周CD4+、CD8+T淋巴细胞均逐渐升高，CD4+／CD8+比值在各组术后1周最高，以后逐渐下降，2周时B、D组较高，A、C、E组比较无明显差别。ELISA法检测外周血清IL-2、IL-4水平，术后D组外周血IL-2、IL-4水平最高，术后1周时达到最高峰，以后逐渐下降，F组水平最低。A、B、C组间比较结果显示，术后不同时间点B组血清中IL-2、IL-4水平均明显高于A组和C组（P＜0．05）。术后6周，各组组织病理学研究发现，D组移植骨材料周围大量淋巴细胞和巨噬细胞聚集；其次为B组，植骨材料周围中等量的淋巴细胞浸润；A组、C组、E组骨材料周围少量淋巴细胞浸润。（5）不同方法处理的异种骨材料修复兔桡骨缺损的研究：不同方法处理的骨材料修复兔桡骨缺损，经放射学和组织学评估，术后6周、12周和24周各组成骨能力依次为：E组＞C组＞A组＞B组＞D组＞F组。结论：（1）α-Gal、MHC-Ⅰ抗原广泛表达在猪骨骨髓细胞和骨细胞、成骨细胞膜及哈佛氏管周围，MHC-Ⅱ抗原主要表达于骨髓细胞。（2）脱脂部分脱蛋白和超深低温冷冻＋酶处理方法可以有效去除异种主要抗原，单纯超深低温冷冻可以明显降低猪骨的异种抗原表达，但是不能完全有效去除异种主要抗原。（3）各组骨材料孔径大小比较，三种处理方法获得的异种骨材料的孔径大小均可满足成骨细胞生长所需要的孔径要求。但是超深低温冷冻组骨材料孔隙率最小，可能会影响成骨细胞的长入。脱脂部分脱蛋白组生物力学性能最差，超深低温冷冻和超深低温冷冻＋酶消化法对猪骨生物力学性能无明显影响，接近正常新鲜猪骨移植组。（4）各组骨材料体外与兔成骨细胞复合培养，超深低温冷冻＋酶消化联合处理后的骨材料的生物相容性优于脱蛋白处理和单纯超深低温冷冻处理。（5）各组骨材料植入兔体内，异种骨移植免疫排斥反应主要发生在术后1-2周，超深低温冷冻＋酶消化组和脱脂部分脱蛋白组骨材料免疫排斥反应较轻，单纯超深低温冷冻组免疫排斥较重。（6）超深低温冷冻＋酶消化组和脱脂部分脱蛋白组骨缺损修复能力无明显差别，两组骨缺损修复能力均明显优于超深低温冷冻组。（7）超深低温冷冻＋酶处理可以有效去除异种骨抗原，同脱脂部分脱蛋白组相比，具有良好的生物力学性能；具备合适的孔径大小和孔隙率，适合成骨细胞生长，具有良好的细胞生物相容性能；体内移植免疫排斥反应较轻微，骨缺损修复能力强，有望将来作为临床异种骨移植处理的有效方法之一。
王德超,刘维钢,杜靖远[10]（2006）在《脱细胞骨基质研究进展》文中进行了进一步梳理因严重创伤及骨肿瘤所致的骨不连、骨缺损严重影响人体生活质量甚至威胁生命,一直是骨科医生的难题。中国每年有数百万人面临骨不连、骨缺损痛苦。目前常用的治疗方法主要是自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植等。这些方法各有优缺点,难以满足临床上修复各种骨缺损的需要。也就是说,目前还没有十分理想的骨移植材料。寻找理想的骨支架材料成为骨组织工程研究的焦点。异体或异种骨成为理想的骨支架材料必须解决两个问题:一是如何降低或消除骨的抗原性;二是如何保留其诱导和促进细胞增殖分化的作
二、猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检测（论文提纲范文）
（1）兔骨移植材料组织学特征及体内埋植3个月病理学观察（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物: |
| 1.1.2 实验仪器: |
| 1.1.3 骨移植材料的制备方法: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 兔骨移植材料的光镜观察和电镜观察: |
| 1.2.2 兔骨缺损模型制作及埋植骨移植材料: |
| 1.2.3 取材: |
| 2 结果 |
| 2.1 骨移植材料的组织学观察 |
| 2.1.1 大体标本观察: |
| 2.1.2 光镜观察: |
| 2.1.3 扫描电镜观察: |
| 2.2 埋植3个月组织学观察 |
| 2.2.1 光镜观察: |
| 2.2.2 扫描电镜观察: |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）去抗原异种松质骨与兔成骨细胞组织相容性的实验研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 实验一：异种松质骨材料的制备及其抗原的检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验二：种子细胞的获取及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验三：异种松质骨材料和兔成骨细胞组织相容性的观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（3）新型脱细胞骨基质材料的制备及理化评估（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 1材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 大体观察 |
| 2.2 扫描电镜观察 |
| 2.3 Micro-CT观察 |
| 2.4 组织学观察 |
| 2.5 生物力学测试 |
| 3 讨论 |
（4）脱细胞骨基质联合骨髓间充质干细胞修复动物骨缺损实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 免疫学特点 |
| 1.2 组织学特点 |
| 1.3 生物学特点 |
| 1.4 BAECM功能 |
| 1.5 洗脱剂选择 |
| 1.6 BAECM的临床应用 |
| 第二章 脱细胞骨基质的制备及其移植免疫分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 脱细胞骨基质的制备 |
| 2.2.2 组织学检测 |
| 2.2.3 扫描电镜观察 |
| 2.2.4 透射电镜观察 |
| 2.2.5 纤维连接蛋白与层粘连蛋白的免疫组化染色 |
| 2.2.6 洗脱剂残留量测定 |
| 2.2.7 血清抗体检测 |
| 2.2.8 淋巴细胞刺激实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 脱细胞骨基质外观 |
| 2.4.2 HE染色及甲苯胺蓝染色 |
| 2.4.3 扫描电镜观察 |
| 2.4.4 透射电镜观察 |
| 2.4.5 免疫组化染色 |
| 2.4.6 洗脱剂残留量测定 |
| 2.4.7 酶联免疫吸附法测定血清抗体 |
| 2.4.8 淋巴细胞刺激指数 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 组织工程骨种植支架的选择 |
| 2.5.2 去除骨支架中导致免疫排斥反应抗原方法的选择 |
| 2.5.3 骨支架材料中的有机成分分析 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 脱细胞骨基质与诱导的成骨样细胞在体外的相容性 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 骨髓间充质干细胞培养及其观察 |
| 3.2.2 骨髓间充质干细胞鉴定 |
| 3.2.3 骨髓间充质干细胞向成骨细胞样细胞的诱导分化 |
| 3.2.4 诱导后的细胞鉴定 |
| 3.2.5 诱导后的细胞周期分析 |
| 3.2.6 脱细胞骨基质与诱导的成骨样细胞在体外的联合培养 |
| 3.2.7 扫描电镜观察 |
| 3.2.8 碱性磷酸酶检测 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 3.4.2 FCM分析细胞表面标志物 |
| 3.4.3 茜素红染色 |
| 3.4.4 碱性磷酸酶染色 |
| 3.4.5 荧光显微镜观察细胞 |
| 3.4.6 FCM分析细胞周期 |
| 3.4.7 扫描电镜观察 |
| 3.4.8 碱性磷酸酶检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 种植到骨支架材料中的种子细胞的选择 |
| 3.5.2 种子细胞与材料联合培养评价 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 动物在体实验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 大鼠股骨缺损的模型制作 |
| 4.2.2 标本植入 |
| 4.2.3 标本处理 |
| 4.2.4 标本包埋 |
| 4.2.5 标本切片 |
| 4.2.6 标本染色 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 荧光显微镜观察 |
| 4.4.2 HE染色及甲苯胺蓝染色 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结及展望 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）以软骨细胞外基质为基础构建组织工程软骨以及骨软骨复合体的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 以人软骨细胞外基质为材料构建三维多孔海绵支架的实验研究 |
| 实验一 人软骨细胞外基质来源的三维多孔海绵支架的制备与评估 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图一 |
| 实验二 软骨细胞外基质来源的三维多孔支架的生物相容性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 第二部分 软骨细胞外基质与壳聚糖复合制备软骨组织工程支架及其性能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图三 |
| 第三部分 骨髓基质干细胞与CEDPS支架复合体外培养组织工程软骨的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图四 |
| 第四部分 PKH26荧光标记骨髓基质干细胞与CEDPS在裸鼠皮下异位构建组织工程软骨的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图五 |
| 第五部分 新型脱细胞骨基质材料的制备与评估 |
| 实验一 脱细胞骨基质材料的制备与理化特性评估 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 脱细胞骨支架的生物相容性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图六 |
| 第六部分 组织工程骨软骨双层支架材料的制备与评估 |
| 实验一 CEDPS/ACBM组织工程骨软骨双层支架材料的制备和评估 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图七 |
| 实验二 等离子体处理胶原锚定PLGA/ACBM骨软骨双层支架材料的制备及评估 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图八 |
| 第七部分 骨髓基质干细胞与CEDPS/ACBM层支架体外构建组织工程骨软骨复合体的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图九 |
| 第八部分 利用骨髓基质干细胞和CEDPS/ACBM双层支架构建组织工程骨软骨复合体修复犬膝关节负重区骨软骨缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图十 |
| 综述 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 英文摘要 引言 |
| 1.骨缺损的修复治疗 |
| 2.富血小板血浆促进成骨的作用 正文 |
| 材料和方法 |
| 1.实验试剂 |
| 2.实验器械 |
| 3.实验材料 |
| 4.实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 附图 文献综述 致谢 |
（7）脱细胞牛松质骨的生物相容性及修复兔桡骨缺损的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 1 生物相容性研究结果 |
| 2 复合 BMSC_S修复兔桡骨节段性骨缺损研究结果 |
| 讨论 |
| 1 骨生物相容性研究 |
| 2 BMSC_S的分离培养及诱导 |
| 3复合 BMSC_S修复兔桡骨节段性骨缺损研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 一 脱细胞骨基质研究进展 |
| 二 骨髓基质干细胞研究进展 |
| 三 骨支架材料研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（8）改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 异种（猪）脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 第二部分 山羊MSCs 培养、鉴定及生物学特性检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 第三部分 异种脱蛋白骨支架材料的相容性研究 |
| 前言 |
| 实验一 异种脱蛋白骨支架材料与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 在体支架材料内BrdU 标记自体MSCs 增殖的大动物示踪研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 第四部分 异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的实验研究. |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述异种骨移植修复骨缺损的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生在读期间发表论文目录 |
（9）猪异种骨移植靶抗原分布及除抗原处理的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 内江猪皮质骨、松质骨靶抗原的强弱及分布特点 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同方法处理的异种骨材料的抗原检测及性状观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 不同方法处理的异种骨材料与兔成骨细胞组织相容性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 不同方法处理的异种骨材料体内移植的免疫学研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 不同方法处理的异种骨材料修复骨缺损的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 综述 1 |
| 综述 2 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
四、猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检测（论文参考文献）
- [1]兔骨移植材料组织学特征及体内埋植3个月病理学观察[J]. 张东辉,党菊霞,许永华,许琴,李建瑛,是文辉,李佳佳,马娜,董翔,卢开伯,龙志新. 实验动物科学, 2012(03)
- [2]去抗原异种松质骨与兔成骨细胞组织相容性的实验研究[D]. 钟超. 成都中医药大学, 2012(03)
- [3]新型脱细胞骨基质材料的制备及理化评估[J]. 杨强,彭江,夏群,马信龙,徐宝山,郭全义,汪爱媛,赵斌,张莉,许文静,卢世璧. 中国组织工程研究与临床康复, 2011(38)
- [4]脱细胞骨基质联合骨髓间充质干细胞修复动物骨缺损实验研究[D]. 李康杰. 延边大学, 2011(04)
- [5]以软骨细胞外基质为基础构建组织工程软骨以及骨软骨复合体的实验研究[D]. 杨强. 中国人民解放军军医进修学院, 2008(09)
- [6]脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损的实验研究[D]. 袁道英. 滨州医学院, 2008(11)
- [7]脱细胞牛松质骨的生物相容性及修复兔桡骨缺损的研究[D]. 王德超. 石河子大学, 2007(06)
- [8]改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究[D]. 简月奎. 第三军医大学, 2007(03)
- [9]猪异种骨移植靶抗原分布及除抗原处理的研究[D]. 冯卫. 四川大学, 2007(04)
- [10]脱细胞骨基质研究进展[J]. 王德超,刘维钢,杜靖远. 组织工程与重建外科杂志, 2006(04)