一、神经激肽A在大鼠结肠发育中的定性定量分析（论文文献综述）
姚致雅[1]（2020）在《肛门直肠畸形大鼠盆底肌发育异常的分子机制及其宫内移植干细胞修复作用的研究》文中认为目的:先天性肛门直肠畸形（Anorectal malformations,ARMs）是最常见的小儿消化道畸形,同时也是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,其发病率为1/5000～1/1500,居消化道畸形首位。研究至今,ARMs的病因仍不清晰,且病理类型及改变繁多而复杂。虽然手术方式不断改进,总病死率及手术死亡率显着下降,但是国内外学者随访发现,部分患儿术后仍存在不同程度的排便功能障碍,对患儿的生活质量及心理健康造成不同程度的影响,给患儿家庭和社会带来沉重的医疗负担和经济压力。便秘、便失禁等不良预后与畸形类型及伴发畸形,如盆底肌发育异常、盆底肌的支配神经发育异常和骶尾椎发育不良等发育缺陷密切相关。在诸多因素中,盆底横纹肌复合体（Striated Muscle Complex,SMC）,是控制排便的关键因素之一,SMC中的肌肉神经发育异常是影响AMRs患儿预后的重要原因之一。相关前期研究已证实,ARMs患儿及实验动物模型中均存在着不同程度的SMC发育异常。表现为肌纤维发育异常、肌梭发育异常与运动终板发育异常。胚胎期SMC的发育过程较为复杂,是诸多环境与遗传因素共同作用的结果。参与其中的分子、通路及通路间相互作用等至今尚不明晰。而在ARMs患儿的SMC组织中不仅存在着肌纤维走行紊乱等病理特征,还存在着肌梭密度降低、运动终板密度降低的异常发育表现。至今为止,针对ARMs中SMC的神经发育异常的研究甚少,其中的发育机制也尚不明晰。因此,本研究利用高通量测序技术,在转录组水平上对ARMs胚胎SMC中异常表达的基因进行筛查,探讨其肌纤维与神经突触发育异常的可能机制。Wnt（Wingless-type MMTV integration site family members）信号通路与骨骼肌的发育密切相关,参与调控骨骼肌生长、发育、再生和疾病的发生。亦有研究表明,Wnt信号通路与神经肌肉接头（Neuromuscular junction,NMJ）的发育相关,而NMJ的结构与功能异常可引起重症肌无力等神经肌肉系统障碍疾病。在不同组织的发育中,Wnt信号通路与其他的信号通路存在交互作用,其中包括骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins,BMPs）、Sonic hedgehog（Shh）和Notch信号通路。本课题组前期研究对Wnt信号通路的差异表达有所研究,但是经典Wnt通路及非经典信号通路中信号转导关键分子及其相互作用通路中关键分子的研究甚少。其下游效应分子的表达情况亦不明晰。Wnt信号通路在ARMs的SMC组织发育过程中究竟通过何种方式起作用,依旧不明朗。同时,BMPs等通路与Wnt通路的交互作用,在不同组织的发育过程中,表达情况以及参与机制亦有不同,而在ARMs直肠组织的发育过程中,上述通路存在差异表达,但是,是否参与中SMC的异常发育过程,亦不明晰。非编码RNA（Non-coding RNA,ncRNA）通过多种机制调控基因的表达,在胚胎发育中发挥着非常重要的作用。在心脏发育,神经系统发育及肌肉发育中,ncRNA都起到重要作用。而在ARMs的盆底肌发育过程中,ncRNA的研究尚属空白,鉴于ncRNA的作用,相关研究亟待开展。肌肉与神经的修复较为困难,尤其是肌肉神经接头的修复,需经历较长的时程与较为复杂的生物学过程。肌源性干细胞（Muscle-derived stem cells,MDSCs）是肌肉来源的,具有多能性的干细胞,不同于肌卫星细胞,MDSCs能打破胚层限制,分化为不同胚层的细胞,例如神经细胞、肌细胞、胰岛细胞、成骨细胞等。因其强大的增殖能力和多向分化潜能,MDSCs被认为是一种颇具前景的基因载体,并被临床医学和组织工程学广泛应用。成肌细胞系是具有体外分化为肌管能力的专能干细胞,不同于MDSCs这类多能干细胞,成肌细胞系只能分化为肌纤维,但其增殖能力强大而且分化方向确定,因而也被认为是适合肌组织修复的干细胞类型。综上,本研究中采用乙烯硫脲（ethylenethiourea,ETU）致畸的Wistar大鼠肛门直肠动物模型。运用转录组测序技术（RNA Sequencing,RNA-Seq）检测对照组与肛门直肠畸形组中差异表达的mRNA、lncRNA和circRNA,并通过富集分析和共表达网络构建等分析方法,来筛查与ARMs胎鼠SMC发育异常相关的分子及信号通路,并探索Wnt信号通路及其相互作用通路中关键分子的表达差异。利用报告基因实验验证lncRNA—miRNA—mRNA间的相互结合,同时体外培养MDSCs和成肌细胞系,鉴定后移植到ARMs胎鼠的SMC区域,观察细胞的定植、存活和分化情况,探索肌源性干细胞移植治疗发育异常的盆底横纹肌复合体的可行性。研究方法:1、动物模型制备及标本收集。Wistar大鼠,体重230～280 g,约12周龄,由辽宁长生生物公司提供,雌雄鼠以5:1比例合笼,次日清晨阴道涂片,显微镜下观察涂片,发现其上有精子者,标记为孕0天（Embryonic day 0,E0）,于E10制作ARMs大鼠动物模型,灌胃喂入以生理盐水溶解稀释的1%ETU（125 mg/kg）致畸,对照组给予等量的生理盐水。E19时,异氟烷吸入麻醉孕鼠,然后剖宫取胎收集标本组织,后续用于切片进行免疫组织化学染色的标本,经过4%多聚甲醛溶液固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明和石蜡包埋过程,于常温条件保存;后续进行Western blot和RT-qPCR（Quantificational reverse transcriptase-polymerase）实验的标本,在解剖显微镜下收集SMC组织,RNA保护液浸润后,深冻冰箱冻存。2、转录组测序筛査ARMs胎鼠与正常胎鼠SMC组织中差异表达的基因。在E19时收集对照组及ARMs组SMC组织,进行高通量测序实验（该项实验由北京博奥晶典生物技术有限公司提供技术服务与支持）。检测E19时对照组和ARMs组中可能存在的差异表达的编码RNA及非编码RNA,利用GO及Pathway分析对数据进行解读与归类,并推测差异mRNA所编码的蛋白间的相互作用,在差异表达的基因与ncRNA中,选取与肌肉发育和神经发育相关的部分基因以及ncRNA,利用RT-qPCR技术对它们的差异表达情况进行验证。3、RT-qPCR技术。提取总RNA后,利用紫外分光光度计检测样品质量与浓度,各样品调整到同一浓度水平,去除基因组DNA后逆转录合成cDNA,各步骤体系按照试剂盒推荐的方法配制,对mRNA、lncRNA和circRNA进行RT-qPCR检测。4、Western blot技术。提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,各样品蛋白浓度调整到同一水平,配胶体系按照试剂盒说明书配制,电泳转印后封闭,一抗按照说明书推荐比例稀释,4℃孵育过夜,二抗常温孵育2 h,滴加发光液,成像拍照。5、免疫组化技术。石蜡切片逐步脱蜡脱苯至水,抗原修复后阻断内源性过氧化物酶,正常非免疫血清封闭,一抗按照说明书推荐比例稀释,4℃孵育过夜,二抗常温孵育30 min,DAB显色,苏木精复染,梯度酒精脱水,中性树胶封片。6、双萤光素酶报告基因实验:利用TargetScan等网站预测结合位点,依据网站提供的序列进行质粒构建并在合成后进行测序和抽提,制备感受态细胞,按组别加入对应的质粒、miRNA和转染试剂到293T细胞中,共转染48 h后检测Luciferase活性,取萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性的比值进行数据分析。7、子宫内MDSCs及成肌细胞系细胞移植修复盆底横纹肌复合体。应用两步消化法及差速贴壁法,从新生雄鼠后肢提取并分离得到MDSCs,体外培养增殖,应用免疫荧光染色法对MDSCs进行鉴定,利用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒（Ad-eGFP）转染MDSCs后,胰酶消化后制成细胞悬液,后续移植入ARMs胎鼠的SMC区域,观察移植后MDSCs在ARMs胎鼠体内SMC区域存活及分化情况。同时,对成肌细胞系进行培养,应用免疫荧光染色法对细胞系进行鉴定,利用Ad-eGFP转染细胞系后,胰酶消化制备成细胞悬液,后续移植入ARMs胎鼠的SMC区域,观察移植后成肌细胞在ARMs胎鼠体内SMC区域存活及分化情况。8、宫内移植干细胞手术及ARMs胎鼠出生后显微造瘘手术。宫内移植干细胞手术:ETU致畸的孕鼠在E19时异氟烷吸入麻醉,切开一侧的子宫角,用浸过温生理盐水的湿纱布覆盖子宫。借助冷光源透过子宫壁找到短尾或无尾的胎鼠,在子宫壁预置荷包缝合线,荷包中心做一个小切口,打开子宫壁及羊膜囊,清晰暴露盆底区域。用微量注射玻璃针将提前制备好的MDSCs或成肌细胞悬液注射到ARMs胎鼠肛凹两侧SMC区域。显微注射完成后将胎鼠轻推回子宫内结扎荷包缝合。4-0外科尼龙线缝合腹壁肌层和皮肤,逐层关腹。记录手术鼠的位置,方便取胎时辨认。手术后对孕鼠进行灯烤复温,待麻醉苏醒后,将其放回笼中继续饲养。E22时,对手术孕鼠行剖宫产取出胎鼠,干燥棉签清理口鼻粘液,轻微按压心脏,直至新生鼠可自主呼吸,肤色开始变红。畸形胎鼠出生成活后,对其进行低温麻醉,麻醉成功后右侧卧位,取头低脚高位;四肢胶带固定,剪开皮肤和腹肌进入腹腔内;寻找直肠或结肠,结扎远端直肠,近端造瘘;尽可能游离肠道,保证造瘘肠道无张力,无回缩,可轻度脱出于造瘘口;术中注意操作轻柔以保护肠管及脏器,避免器械划伤重要血管;肌层与皮肤间断缝合,缝合过程避免牵拉或划破肌层;术后生理盐水擦净血迹,加热恒温板复温,埋于旧垫料中,归于母鼠。每日扩瘘两次,早晚各一次,于手术显微镜下,显微器械去除造瘘口分泌物,直至可见黄色粪便,注意不要划破皮肤及肠道,生理盐水冲洗,擦净后归还母鼠。9、应用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析,正常组与ARMs组差异的比较,先判断数据是否符合正态分布,若呈正态分布或近似正态分布则采用独立样本t检验,相关性采用Pearson检验,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,统计值p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1、高通量测序筛查,筛查条件为│log2FC│≥1且p-value<0.05。log2FC即差异表达倍数再取以2为底的对数,log2FC≥1即为上调的差异基因,log2FC≤-1为下调的差异基因。ARMs组与对照组相比,表达上调的mRNA 886个,下调的mRNA 522个;上调的lncRNA 218个,下调lncRNA 254个;上调circRNA 191个,下调circRNA130个。通过分类及富集分析,对数据进行初步归类与筛选,利用RT-qPCR技术对差异表达的部分基因以及ncRNA进行验证,主要选择与神经发育和骨骼肌发育相关的基因以及ncRNA,证实测序结果中m RNA准确率为86.67%,lncRNA准确率为60.00%,circRNA准确率为77.78%2、利用RT-qPCR、Western blot及免疫组织化学染色技术对WNT7A、β-Catenin和BMP2的mRNA及蛋白的表达水平进行验证,同时利用Western blot检测Phospho-β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达水平;发现ARMs胎鼠SMC中WNT7A、β-catenin和BMP2表达明显升高,与测序结果一致,同时ARMs胎鼠SMC中Phospho-β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达水平亦明显升高。3、利用靶基因预测软件miRanda对高通量测序结果中存在差异表达的lncRNA和mRNA的靶向miRNA进行预测,依据ceRNA机制,筛选出如下可能存在靶向调控关系的3个分子对:TCONS＿00051629—Syt7;TCONS＿00051629—Retn;TCONS＿00028283—Dkk3。在ARMs的SMC组织中,利用RT-qPCR、Western blot和免疫组织化学染色技术进行表达水平的验证,证实如上3个分子对中,二者的差异表达趋势相同。利用TargetScan等软件进一步预测能与lncRNA及其靶向mRNA相互结合的miRNA以及结合位点。通过取交集的方法筛选miRNA,构建质粒并利用双萤光素酶报告基因实验,证实TCONS＿00051629—rno-miR-326-3p—Retn、TCONS＿00051629—rno-miR-330-5p—Retn、TCONS＿00028283—rno-miR-193a-5p—Dkk3、rno-miR-328a-3p—Dkk3和rno-miR-3584-5p—Dkk3之间存在结合位点并起到调控作用。4、提取的肌源性干细胞经体外培养24 h后PAX7蛋白免疫荧光染色呈阳性,48h后Desmin蛋白免疫荧光染色呈阳性。MDSCs经Ad-eGFP转染后,荧光显微镜下观察出现绿色荧光,原位注射移植到ARMs胎鼠SMC区域,移植后MDSCs在ARMs胎鼠体内存活,并表达成熟肌细胞特异性蛋白MYH。成肌细胞系细胞体外培养并经免疫荧光染色实验证实,PAX7蛋白和Desmin蛋白表达阳性。成肌细胞系经Ad-eGFP转染后,荧光显微镜下观察出现绿色荧光,移植到ARMs胎鼠SMC区域,可在ARMs胎鼠体内存活,并表达成熟肌细胞特异性标记蛋白MYH。结论:1、ARMs的SMC组织在转录组层面存在明显异常改变,包括1408个mRNA、472个lncRNA和321个circRNA异常上调或下调,主要富集在与神经肌肉的发育与疾病相关的通路中。2、WNT7A、β-catenin和BMP2的mRNA及蛋白的表达水平在ARMs胎鼠SMC中明显升高;Phospho-β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达水平亦明显升高。3、TCONS＿00051629—Syt7;TCONS＿00051629—Retn;TCONS＿00028283—Dkk3中的lncRNA、mRNA和蛋白在ARMs的SMC中存在同向表达趋势,TCONS＿00051629可通过与rno-miR-326-3p或rno-miR-330-5p竞争性结合调控Retn的表达;TCONS＿00028283可通过与rno-miR-193a-5p竞争性结合调控Dkk3的表达;同时rno-miR-328a-3p—Dkk3和rno-miR-3584-5p—Dkk3间存在调控关系。4、肌源性干细胞和成肌细胞系在移植至ARMs胎鼠盆底SMC区域后,能定植存活并分化成为成熟的肌细胞。
曹菲[2]（2019）在《维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究》文中研究指明心肌致密化不全（non-compaction of ventricular myocardium,NVM）又称之为心室肌小梁过多、海绵状心肌,是一种特殊类型的心肌病,由薄而致密的心外膜下心肌层和增厚的非致密的心内膜下心肌层的双层心肌构成,且非致密化心内膜下心肌层表面可见多个显着突起的肌小梁和小梁间深凹的隐窝与心室腔相通并有血流进出。本文第一章对NVM的命名、流行病学、分类、病因和发病机制、病理解剖学、病理生理学和临床表现、临床诊断与鉴别诊断、治疗及其预后等国内外研究进展进行系统性综述。因NVM具有发病率高、病因不明、无有效治疗方法,死亡率高及预后差等特点,故通过建立NVM动物模型揭示其发病机制具有重要科学价值和临床价值。本课题主要针对维甲酸（retinoic acid,RA）诱导NVM小鼠模型并进行相关基础研究。研究内容分为三部分:1.探讨如何运用RA诱导孕鼠子代建立NVM小鼠模型;2.在成功建立NVM小鼠模型后,运用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（tandem mass tag,TMT）检测NVM心脏组织差异蛋白;3.运用平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）技术对NVM差异蛋白进行验证和定量分析,进而发现潜在的与NVM发生相关蛋白,为后续蛋白功能验证、探索NVM相关发病机制以及潜在治疗靶点的可能性提供研究基础。第一部分:根据前期关于精确浓度RA与正常胚胎心肌致密化发育过程密切相关的研究报告,提出了采用过量RA干扰孕鼠胚胎心肌致密化过程而诱导孕鼠子代建立NVM模型的假设。本研究在孕鼠怀孕第8.5天给予全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）70mg/kg诱导孕鼠胎儿NVM。组织病理学证实RA干预组孕鼠子代表现出典型的NVM病理学特征。研究中进一步发现与对照组相比,RA干预组孕鼠子代平均体重明显减低,显示统计学显着差异（P<0.0001）。给予ATRA10天后母鼠平均体重较给药前明显下降,表现出显着的统计学差异（P<0.0001）。结论:过量的ATRA可诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型,并提示过量的ATRA可能参与母鼠及其子代能量代谢过程。该动物模型为下一步TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织建立基础。第二部分:在RA诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型后,运用TMT相对定量蛋白质组学技术开展RA诱导NVM的基础研究。在RA干预组（RA）与空白对照组（Control）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白68个;在RA干预组（RA）与DMSO对照组（DMSO）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白48个。经过基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析发现,RA与两个对照组的共同差异表达蛋白及其通路主要表现在能量代谢和凝血功能方面。结论:根据已有大量此类蛋白功能相关研究,初步推测RA诱导孕鼠子代NVM与能量代谢异常相关的可能性较大,而NVM心室内血栓形成与凝血功能异常相关的可能性较大,其具体致病机制尚待进一步研究。第三部分:在TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织进行差异表达蛋白筛选和分析之后,运用PRM技术对差异蛋白进行验证和定量分析。分别对Control、DMSO以及RA三组中9例幼鼠心脏样品中6种差异蛋白激肽原1（kininogen-1,KNG1）、α1抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin,A1AT）、载脂蛋白 A1（apolipoproteinA-I,ApoAI）、β2 糖蛋白 1（beta-2-glycoprotein1,β2GP1）、微管蛋白β4a 链（tubulinbeta-4Achain,TUBB4A）、水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP4）的 12条肽段进行PRM定量分析,结果表明:这6种蛋白的表达与TMT检测的相对定量结果一致,存在显着差异。对这6种蛋白的结构、功能及所在相关通路以及与NVM可能的相关性进行分析总结,将为后续NVM相关蛋白功能验证,了解NVM相关发病机制及靶向治疗提供进一步的研究方向。
孔竞谊[3]（2019）在《硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究》文中研究说明目的:观察硝菔通结方对慢传输型便秘（STC）模型大鼠结肠动力、肠神经系统网络结构（ENS-ICC-SMC）及结肠细胞自噬与凋亡的影响,从细胞自噬与凋亡调控组织结构功能稳态的角度探讨硝菔通结方治疗STC的作用机制,为补肾益精法治疗便秘提供新的研究思路。方法:1.随机将SD大鼠110只分为空白组40只,造模组70只。运用大黄粉混悬液递增剂量三轮循环法对造模组大鼠进行慢传输型便秘模型复制,并在造模过程中粪便形质改变的3个时间节点每组各取10只大鼠处死,HE染色观察结肠病理,免疫荧光铺片观察肌间神经丛,透射电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构及自噬体,Western-Blot检测结肠肌层ENS-ICC相关蛋白PGP9.5、c-kit、Cx43、Sy,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、caspase-3表达水平,TUNEL法检测结肠肌层细胞凋亡情况。造模结束后根据大鼠首粒黑便排出时间,判断造模是否成功。2.造模成功后将剩余大鼠分为空白组（K组）,模型组（M组）、莫沙必利组（S组）、张锡纯硝菔通结汤原方组（Z组）及硝菔通结方组（X组）,予以对应药物灌胃4周。观察各组大鼠的体质量、首粒黑便排出时间、便量,检测在体结肠肌电。取结肠组织,HE染色观察病理学,免疫荧光铺片观察肌间神经丛,透射电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构;免疫荧光及Western-Blot检测肌层PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43、Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、mTOR的表达水平;RT-PCR检测肌层Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3mRNA的表达水平。结果:1.STC模型大鼠ENS-ICC-SMC与结肠细胞自噬、凋亡的变化（1）ENS-ICC-SMC形态学变化:随着造模程度的发展,HE染色出现炎性细胞浸润,固有膜肿胀,肌层纤维坏死,肌细胞核固缩、深染或溶解消失,肌间神经丛神经细胞空泡变性、数量减少;肌间神经铺片显示结肠肌间神经丛神经分布逐渐稀疏,神经元变少,纤维及胞体细小;透射电镜显示肠神经细胞线粒体肿胀,甚则形成空泡样结构,偶见自噬小体及凋亡现象;ICC少见,偶有可见其细胞核较大,核内染色质边集,细胞质内少量线粒体,线粒体肿胀,胞质内空泡形成;平滑肌细胞细胞核染色质边集,胞质内可见大量空泡等病理性改变;细胞间隙变宽。（2）ENS-ICC相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠PGP9.5、Cx43有减少趋势（P>0.05）,c-kit、Sy表达减少（P<0.05）,造模2、3阶段大鼠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43表达均减少（P<0.05/P<0.01）。（3）自噬相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠Beclin-1表达增多,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值减小（P<0.05）,p62表达有减少趋势（P>0.05）;造模2阶段大鼠Beclin-1表达减少（P<0.05）,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值有增大趋势,p62表达有增多趋势（P>0.05）;造模3阶段大鼠Beclin-1表达减少,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值增大,p62表达增多（P<0.01）。（4）凋亡相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠bcl-2/bax的比值及caspase-3表达无明显变化（P>0.05）;造模2、3阶段大鼠bcl-2/bax的比值减小,caspase-3表达增多（P<0.05/P<0.01）;TUNEL法显示造模2、3阶段大鼠结肠肌层中细胞凋亡增多（P<0.01）。2.硝菔通结方对大鼠体质量、首粒黑便排出时间、便量及结肠肌电的影响（1）对体质量的影响:相较于K组,M组体重增长缓慢（P<0.01）;相较于M组,各给药组大鼠体重增长加快（P<0.01）。相较S组及Z组,X组大鼠体重增长较快（P<0.05）。（2）对首粒黑便及便量的影响:相较于M组,各组大鼠首粒黑便排出时间变短,便量增多（P<0.01）;相较于Z组,X组大鼠便量增加（P<0.05）。（3）对结肠肌电的影响:相较于K组,M组频率减慢、振幅减小（P<0.01）;相较于M组,S组及X组频率增加,振幅加大（P<0.05/P<0.01）,Z组频率增加（P<0.05）,振幅有加大趋势（P>0.05）。3.硝菔通结方对STC模型大鼠结肠ENS-ICC-SMC的影响（1）对ENS-ICC-SMC形态学的影响:各给药组HE染色显示炎性浸润减轻,肌层纤维坏死减少,肌细胞及肌间神经丛神经细胞变性减轻;肌间神经丛铺片显示神经丛神经分布增多,神经元数量及形态恢复;透射电镜显示神经细胞、ICC、SMC内线粒体肿胀等病变减轻,ICC增多,细胞连接增强,以X组最明显。（2）对ENS-ICC相关蛋白的影响:M组PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43荧光强度弱于K组,各给药组荧光强度强于M组;蛋白印迹法显示S组及X组PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43的表达增多（P<0.05/P<0.01）,Z组PGP9.5表达有增多趋势（P>0.05）,c-kit、Sy、Cx43的表达增多（P<0.05）;相较于Z组,X组PGP9.5、Sy、c-kit的表达增多（P<0.05）。4.硝菔通结方对STC模型大鼠结肠自噬与凋亡的影响（1）对自噬相关蛋白的影响:M组Beclin-1、LC3荧光强度弱于K组,p62荧光强度强于K组,各给药组Beclin-1、LC3荧光强度强于M组,p62荧光强度弱于M组;蛋白印迹法显示S组及X组Beclin-1表达增多（P<0.05/P<0.01）,Z组及X组p62表达减少（P<0.05/P<0.01）,LC3Ⅰ/Ⅱ的比值减小（P<0.05）;相较于Z组,X组Beclin-1表达增多,p62表达减少（P<0.05）,相较于S组,X组p62表达减少（P<0.05）。（2）对自噬相关mRNA的影响:相较于K组,M组大鼠Beclin-1、LC3、p62 mRNA的表达量降低（P<0.01）;相较于M组,S组及X组大鼠Beclin-1mRNA的表达量增多（P<0.05/P<0.01）,相较于Z组,X组大鼠Beclin-1 mRNA的表达量增多（P<0.05）,各组LC3、p62 mRNA无明显变化（P>0.05）。（3）对凋亡相关蛋白的影响:M组bcl-2、bax、caspase-3荧光强度强于K组,各给药组荧光强度弱于M组;蛋白印迹法显示S组及X组bcl-2/bax的比值增大（P<0.01）,caspase-3表达减少（P<0.05/P<0.01）,Z组bcl-2/bax的比值有增大趋势,caspase-3表达有减少趋势（P>0.05）,相较于Z组,X组bcl-2/bax的比值增大（P<0.05）。（4）对凋亡相关mRNA的影响:相较于K组,M组bcl-2、bax、caspase-3 mRNA表达升高（P<0.01）;相较于M组,各组bcl-2 mRNA表达有减少趋势（P>0.05）,bax mRNA减少（P<0.05）,Z组caspase-3 mRNA表达有减少趋势（P>0.05）,S组及X组caspase-3 mRNA表达减少（P<0.05）。（5）对mTOR的影响:M组荧光强于K组,各给药组荧光弱于M组;蛋白印迹法显示相较于K组,M组p-mTOR表达增多,p-mTOR/mTOR的比值增大（P<0.01）;相较于M组,S组及Z组p-mTOR/mTOR的比值有减小趋势（P>0.05）,X组p-mTOR蛋白表达减少,p-mTOR/mTOR的比值减小（P<0.05）。结论:1.慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍与肠神经系统网络结构损伤程度有关,自噬与凋亡异常可能参与其肠神经系统网络结构损伤过程。2.硝菔通结方能改善慢传输型便秘模型大鼠的便秘症状,缩短首粒黑便排出时间,增加粪便量,增强结肠肌电频率和振幅,促进肠神经系统网络结构修复,提高PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43表达。3.硝菔通结方可能通过抑制结肠肌层mTOR磷酸化,增多Beclin-1的表达,减小LC3Ⅰ/Ⅱ比值,减少p62的表达,增强细胞自噬活性,减少bax表达,增大bcl-2/bax比值,减少caspase-3表达,减少细胞凋亡。4.硝菔通结方可能通过调控结肠细胞自噬及凋亡,促进肠神经系统网络结构修复,进而纠正慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍,改善便秘症状,补肾益精法在其中发挥重要作用。
徐岩[4]（2018）在《瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景急性胃黏膜损伤（Acute gastric mucosal lesions,AGML）指胃黏膜屏障保护作用减弱,胃黏膜发生不同程度的水肿、溃疡、糜烂和出血,是一种常见的临床问题。尽管有很多治疗急性胃黏膜损伤的药物,但是胃黏膜损伤经常容易复发,并且患这种疾病病人的数量一直保持在一个稳定状态。过度、持续性伤害性应激是诱发急性胃黏膜损伤的一个关键性致病因素,胃是应激状态下最为敏感的器官之一。现有研究显示,各种困难复杂的手术、休克、严重感染、脓毒症、多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome or failure,MODS or MODF）和严重烧伤、创伤等都可引起AGML。特别是休克引起的低血流灌注,均能减少胃壁血流,损伤胃黏膜屏障,影响胃黏膜上皮细胞的功能,发生应激性胃黏膜水肿、溃疡甚至糜烂出血。与应激相关的胃黏膜损伤估计影响75%以上的急危重病人,其中3%-4%可发生严重的胃出血,这可使原有疾病加重或恶化,病死率明显升高。在ICU与应激相关的胃出血发生率为0.6%-6%。有研究表明应激性溃疡与胃酸分泌增多的关系不大,更依赖于胃黏膜血流量的减少、缺血缺氧和再灌注损伤。任何影响胃壁血流（Gastric wall blood flow,GWBF）的因素都会对胃黏膜上皮细胞（Gastric mucosal epithelial cells,GMEC）的功能产生影响,削弱胃黏膜保护屏障。胃酸增多显然能加重胃黏膜防御系统的负荷,但是应激性溃疡时胃酸一般不高,甚至减少。尽管如此,仍不能否定H+在应激性胃溃疡发病中的作用。由于胃黏膜屏障受损,H+浓度虽然不高,仍可逆行性扩散,出现胃壁内酸化,则可产生急性胃黏膜损害。此外,一些炎性介质的失控和代谢产物也会对胃黏膜的功能产生影响。尽管存在上述一些已经明确影响胃黏膜功能的因素,但是应激诱导急性胃黏膜损伤的病理生理机制仍然还不是很清楚。考虑急性胃黏膜损伤受多因素、多途径调控,因此,迫切需要寻找与急性胃黏膜损伤发病机制相关的新的信号分子和信号传导通路,为防治疗急性胃黏膜损伤提供靶点。目前认为,AGML的发生与神经和体液等诸多因素有关。瞬时受体电位锚蛋白1（Transient receptor potential ankyrin-1,TRPA1）和P物质（Substance P,SP）都丰富表达且共存表达于大鼠的胃组织和支配胃组织相应阶段胸8-胸11（T8-11）背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）,这样二者之间可能存在某种相互作用。Kondo T报道TRPA1参与大鼠内脏痛觉过敏的调节,预先鞘内注射和腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-030031或敲除TRPA1可以有效减轻大鼠胃扩张引起的伤害性刺激。给予P物质神经激肽-1受体拮抗剂SR140333和CP 99994可以分别有效减轻酒精引起的C57/BL6J小鼠胃损伤和SD大鼠浸水束缚应激引起的膀胱损伤。有报道TRPA1和P物质均可引起神经源性炎症和非神经源性炎症。在2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic-acid,TNBS）诱导的小鼠结肠炎模型,TRPA1对P物质的释放具有调控作用,但是二者在急性胃黏膜损伤中的作用尚不明确。研究目的冷水束缚应激（Water immersion restraint stress,WIRS）因为其良好的可重复性和临床相关性,被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此,本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型,初步探讨:1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响,观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate,AITC）,进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制,以及TRPA1对P物质释放的影响。研究方法雄性Wistar大鼠（weight 180-220g,6–8weeks old）,随机分为6组,空白对照组（Control group）,大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组（WIRS group）,大鼠在自制的鼠笼内冷水（16±1℃）浸泡6h,水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组（ITIH group）,大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-030031 10μl（10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亚砜）;腹腔注射HC-030031组（IPIH group）,大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031（150 mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纤维素）。冷水束缚应激6h后,取大鼠的背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜。AITC组,口服AITC 17mg/kg（AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐温的生理盐水中）,AITC对照组口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜,应用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin stain,HE）或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后,分别应用光学显微镜（Optical Microscope,OM）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）、免疫组织化学（IHC）分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胃黏膜中P物质浓度的变化。实验结果1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示,未经处理的Control组:胃黏膜结构正常,层次清楚,上皮完整,上皮层细胞排列紧密、规则,未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集,未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落,多发浅表溃疡,有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落,同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润,毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显,数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较,WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高（P<0.001）。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好,受损黏膜较表浅局限,仅有轻度充血、水肿,偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低（P<0.001）。AITC组:可见胃黏膜受损,上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿,可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较,AITC组胃黏膜损伤评分明显提高（P<0.001）。2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示,未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重,有些完全失去正常结构,轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较,胃黏膜细胞损伤评分明显提高（P<0.001）。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤,但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张,空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低（P<0.001）。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤,多伴有线粒体嵴减少或消失,但轮廓存在;粗面内质网局部扩张,偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较,AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高（P<0.001）。3.同Control组比较,WIRS组大鼠背根神经节（T8-11）和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加（P<0.001）。4.同WIRS组比较,鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003（1ITIH组或IPIH组）,有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中P物质释放（P<0.001）。5.同Control组比较,口服TRPA1特异性激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤,大鼠背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加（P<0.001）。结论1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤,使背根神经节（T8-11）和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关,其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤,其机制可能是HC-030031显着抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放,减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。3.TRPA1激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中,P物质的释放主要由TRPA1调控。
吴佳佳[5]（2017）在《“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠Th17/Treg及肠道菌群的影响》文中认为目的:以大承气汤为“从肠论治”的实验方,过敏性哮喘小鼠为肺病模型,着眼于“从肠论治”对肺肠免疫细胞分化及肠道菌群的影响,探究“从肠论治”的细胞分子机制,为肺肠理论指导临床实践提供可靠的循证依据。方法:1构建过敏性哮喘小鼠模型及给药方案:本研究选取成年雌性C57BL/6小鼠为实验对象,分组情况视每次实验目的不同而定,整个研究过程基本包括4组,即正常组、模型组、“从肠论治”组及阳性药对照组。采用卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导激发建立过敏性哮喘小鼠模型,全程可分为两个阶段:（1）两次致敏:分别于第0、14天,腹腔注射由OVA和氢氧化铝配制而成的抗原液。（2）雾化激发:自第21天起,1%的OVA溶液连续雾化激发7天,1次/天,30分钟/次。正常组予以无菌生理盐水腹腔注射及雾化吸入。“从肠论治”组,阳性药对照组于每次雾化前1h灌胃给药,正常组及模型组予等量生理盐水。2过敏性哮喘小鼠肺肠病理形态的动态观察:模型组设有造模第7天、造模21天、造模第26天和造模第28天取材。取小鼠左肺下叶和大、小肠,10%甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,镜下观察拍照。3探究过敏性哮喘小鼠其他非黏膜组织的损伤情况:分别取正常组和模型组小鼠心、肝、肾组织,进行常规病理组织切片,HE染色,镜下观察两组小鼠各组织的病理形态。全自动生化分析仪测定两组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）水平,判断小鼠的肝肾功能是否正常。4“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠炎症的影响:通过观察肺组织大体形态、肺指数、肺组织HE染色及PAS染色反映“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺部炎细胞浸润和黏液分泌情况的影响。大、小肠形态学观察、测定肠组织长度及病理HE染色,观察“从肠论治”后肠道炎症的变化。5“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠Th17/Treg的影响;无菌获取肺淋巴细胞和大肠固有层淋巴细胞,采用细胞流式染色法,流式细胞仪分析细胞并获得数据,比较各组淋巴细胞总数、Th17细胞和Treg细胞百分比的变化。6“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肠道菌群的影响;提取小鼠粪便中肠道菌群的16SrDNA,进行V3-V4区域基因序列检测,分析各组小鼠肠道菌群多样性的变化以及各组小鼠肠道菌群总数、肠杆菌科、肠球菌科、乳酸杆菌科、双歧杆菌科、拟杆菌科及梭杆菌科等主要菌群含量的变化情况。结果:1过敏性哮喘小鼠的一般情况:（1）体重变化:正常组和模型组小鼠体重变化平稳,无明显差异（p>0.05）。（2）粪便变化:模型组小鼠平均粪便粒数减少、粪便含水率下降（p<0.05）,粪便湿重明显下降（p<0.01）,较模型组相比。（3）激发阶段表现:模型组小鼠异常活跃,狂躁不安,抓耳挠鼻,出现呼吸急促,弓背等表现。2过敏性哮喘小鼠肺肠损伤的动态变化及特异性:（1）肺肠HE结果表明,在致敏阶段,肺肠组织结构均正常,未发现病理变化。雾化激发5天后,肺组织内出现炎性细胞浸润,大肠组织固有层也可见淋巴细胞的增多;雾化激发7天后,肺与大肠的炎性改变更加明显。（2）小肠、心、肝、肾HE结果显示均为正常组织形态,而且生化检测也表明哮喘小鼠肝肾功能正常。3各组小鼠肺大体形态、肺指数、肺组织HE染色及PSA染色结果:与正常组相比,模型组小鼠肺大体观有充血、肿胀等表现,肺指数明显增加（p<0.01）,肺组织内几乎不见无正常肺泡结构,支气管周围有大量炎细胞,气管黏液分泌增加。“从肠论治”组肺指数较模型组有所下降（p<0.05）,阳性药对照组肺指数也明显降低（p<0.01）,两组小鼠肺组织炎性病理损伤有明显改善。4各组小鼠大、小肠形态、长度及HE染色结果:与正常组相比,模型组大、小肠未见有组织充血,水肿等变化,大肠长度显着增加（p<0.01）,黏膜固有层,肌层见大量淋巴细胞浸润;与模型组相比,“从肠论治”组大肠长度明显变短（p<0.01）,大肠炎性损伤减轻。三组小鼠小肠均为正常组织结构,长度未增长或变短（p>0.05）。5各组小鼠肺肠淋巴细胞总数、Th17细胞及Treg细胞百分比结果:与正常组比,模型组小鼠肺组织和大肠固有层淋巴细胞总数、Th17细胞百分比明显增加（p<0.01）,肺组织中Treg比例明显减少（p<0.01）,大肠固有层Treg细胞未发生明显变化（p>0.05）;与模型组相比,“从肠论治”组肺组织和大肠固有层淋巴细胞总数,Th17百分比均减少（p<0.05）,肺组织Treg百分比增加（p<0.05）,大肠固有层Treg基本无变化（p>0.05）。6各组小鼠肠道菌群的变化情况:（1）肠道菌群多样性的变化:与正常小鼠相比,过敏性哮喘小鼠肠道菌群的结构发生改变,乳杆菌属的比例明显减少,普雷沃菌属的比例增加;Beta多样性分析显示:模型组小鼠肠道菌群的多样性发生了较大的变化,较正常小鼠相比,而且NMDS分析也显示正常组与模型组小鼠的肠道菌群存在一定的差异性。经大承气汤“从肠论治”后,肠道乳杆菌属比例增加,一定程度改善了肠道菌群的多样性。（2）肠道主要固有菌群的定性、定量分析:①菌群测序结果:与正常组相比,模型组小鼠肠道菌群总数减少（p<0.01）,肠杆菌科及肠球菌科数量增加（p<0.05）,乳酸杆菌科数量降低显着（p<0.05）,双歧杆菌科、拟杆菌科及梭杆菌科无明显变化;经大承气汤“从肠论治”后小鼠道菌群总数增加不显着（p>0.05）,肠杆菌科数量下降（p<0.05）,肠球菌科和乳酸杆菌科无明显变化（p>0.05）;未检测到分节丝状杆菌科。（2）平板活菌计数法结果:与正常组相比,模型组粪便中大肠杆菌,肠球菌含量量显着增加（p<0.01）,乳酸杆菌数量明显降低（p<0.01）;经大承气汤治疗后大肠杆菌、肠球菌均减少（p<0.01）,乳酸杆菌增加（p<0.05）;双岐杆菌及类杆菌在各组含量无明显差异（p>0.05）。结论:1过敏性哮喘小鼠的大肠组织可发生炎性损伤,伴发大肠传导功能失常,而其他非黏膜组织,如心、肝、肾无任何异常。2“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠炎症有一定改善作用,其作用的可能机制是:大承气汤“从肠治肺”,药物直接作用于肠道,调节了哮喘小鼠肠道微生态的平衡,减少肠道Th17细胞的分化,通过黏膜免疫系统间的相互影响,肺部失衡的Treg/Th17也得到了纠正,最终缓解了肺部炎症。
苏联麟[6]（2017）在《基于UPLC-Q-TOF/MS技术的生、醋五味子抗肝损伤效应物质基础及代谢组学研究》文中研究指明随着大健康时代的到来,中医药的传承、发展迎来了新的曙光,面临着前所未有的机遇和挑战,毋庸置疑,中药的发展在其中发挥着举足轻重的作用。中药饮片在中医临床用药中发挥的核心作用正日益凸显,但指导其合理应用的中药炮制理论尚缺乏现代科学论据,临床用药混、乱、杂的现象依然存在,已成为制约中医药发展的瓶颈。中药炮制是一门大学问,药材经过炮制改变的不仅仅是成分,还有药效、药性、归经等,依据化学成分含量来定性中药质量不能充分反映其内在品质。本课题以中药五味子为研究对象,从五味子炮制前后物质基础的变化、生醋五味子木脂素类成分在大鼠体内代谢差异以及生醋五味子抗酒精性肝损伤的代谢组学等研究,较为系统深入的对五味子醋制内在机制进行探索,五味子的临床应用提供科学的理论依据。实验研究主要分三个部分:第一部分五味子醋制前后潜在化学标记物的筛选;第二部分为生、醋五味子提取物体内代谢研究;第三部分为生、醋五味子抗酒精性肝损伤作用的代谢组学研究,其中前两部分属于效应物质基础研究范畴。1.五味子醋制前后潜在的差异化学标记物研究 本研究建立了超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）与多元统计分析相结合的方法,迅速地筛选出炮制前后潜在的差异化学成分,即化学标记物。通过与文献或数据库的参考化合物比较质谱、保留时间和/或暂定分配的经验分子式来进行潜在化学标记物的鉴定。这些潜在的化学标记物不仅用于区分中药材和加工炮制品,而且还可能是效应物质基础的中药组成部分。利用上述方法,本研究筛选了五味子醋制前后差异性成分40个,其中生、醋五味子之间显着性差异成分8个（即化学标记物）。鉴定并确认了其中的5个化学成分,分别是5-羟甲基糠醛、五味子甲素及其同分异构体、五味子乙素和五味子酯丁。而其余3个化学标记物通过解析一级、二级质谱信息,推测它们很可能也属于木脂素类成分。其中的五味子乙素和5-羟甲基糠醛具有极显着性差异,被确定为最具代表的化学标记物。综上所述,五味子醋制前后其化学成分的确发生了一系列复杂的变化,尤其是木脂素类成分。因此,推测木脂素类成分为五味子醋制保肝的重要效应物质基础。2.生、醋五味子提取物肝损伤大鼠体内代谢研究 研究表明,五味子醇提取物中主要成分为木脂素,经对照品确认及含量测定的木脂素有五味子甲素（Deoxyschizandrin）、五味子乙素（Schisandrin B）、五味子丙素（Schisandrin C）、五味子醇甲（Schizandrol）、五味子醇乙（Schizandrol B）、五味子酯甲（Schisantherin）、五味子酯乙（Schisantherin B）、五味子酚（Schisanhenol）、戈米辛J（Gomisin J）及戈米辛G（Gomisin G）等,其中前8种木脂素含量较高。近年来,五味子木脂素代谢产物研究多局限于单体成分,提取物给药后体内的代谢研究还未见详尽的报道。近几年,国内外学者对五味子预防酒精性肝损伤的作用的研究较为普遍。大量研究也表明,五味子对急慢性肝损伤有较好的改善效果,因此,本研究选择较为经典、模型复制稳定可靠并受普遍认可的大鼠急性酒精性肝损伤模型作为研究对象。研究中药在体内的代谢产物,可逆向鉴定被吸收或者发生疗效的成分,大大加快有效成分群的确定,促进中药及其炮制品的物质基础与作用机制的揭示。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技术,并利用质量亏损滤过（MDF）方法,实现中药生物样品复杂基质中目标代谢产物的快速寻找,并对生、醋五味子醇提取物中的主要活性成分木脂素在大鼠体内代谢产物进行差异性比较研究。结果表明,木脂素在体内主要发生脱甲氧基、脱亚甲基及氧化反应;与原型化合物相比,相应的代谢产物的保留时间有所缩短,即极性增强。绝大多数木脂素代谢产物在生、醋五味子组的血浆、胆汁、尿液或粪便样品中都有分布,然而醋五味子组的代谢产物除M18外,其余的在胆汁中都有分布且含量较高,而生五味子组近一半的代谢产物未在胆汁中被检出或响应过低。五味子经醋制后的确改变了总木脂素的组成配比,从而导致一些木脂素成分的吸收、分布及代谢差异;醋五味子组的木脂素代谢产物在胆汁及粪便中的分布显着高于生五味子组。木脂素代谢产物在胆汁与粪便中的分布差异,提示其机理可能与“肝肠循环”及肠道菌群有关。通过上述研究,以期为进一步探讨五味子醋制增强保肝效应的物质基础和作用机制提供了重要依据。3.生、醋五味子抗酒精性肝损伤代谢组学研究 肝脏是机体物质代谢的中枢,其代谢转化与吞噬解毒功能对机体有重要保护作用。目前,文献报道的五味子治疗急性酒精性肝损伤（Acute alcoholic liver injury,AALI）作用机制的研究大多数是从药理作用、肝药酶等分子角度进行的。从代谢组学的视角探讨醋制对中药五味子的影响鲜有报道。课题组经前期研究发现,五味子醋制后可以促进大鼠的胆汁分泌,其胆汁排泄总量与生五味子组相比具有显着性差异,本研究以大鼠体内的血浆、胆汁生物样本为研究对象,从整体代谢组学的角度探讨醋五味子对酒精性肝损伤的影响。本研究采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）并运用模式识别的统计学分析方法,研究生、醋五味子进行药物干预后对AALI模型大鼠血浆、胆汁中代谢物组的扰动,挖掘潜在的生物标记物,寻找五味子预防或治疗AALI可能的作用机制,以期阐述五味子醋制后保肝作用增强的科学内涵。采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学技术,并结合主成分分析（PCA）和正交校正的偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等分析方法筛选、鉴定肝损伤相关的生物标记物。正常对照组、模型组、生五味子及醋五味子组血浆、胆汁代谢物谱得到明显分离,发现并鉴定了血浆中PC、PG、PE、TG、Phytosphingosine、Palmitoyl Serinol 等 21 个差异代谢物;胆汁中 LysoPC（20:4）、PG（18:0/18:1）、12-ketodeoxycholic acid、TG（64:2）等 20 个与肝损伤相关的潜在生物标志物。说明急性酒精性肝损伤大鼠的脂质代谢、胆酸代谢和氨基酸代谢等发生异常。AALI模型大鼠给予生、醋五味子后可使上述标志物代谢水平向正常状态转归,且醋五味子的调节作用强于生五味子（P<0.05）,表明五味子经醋制增强抗肝损伤的作用机制可能与调节上述代谢途径相关。本课题在前期研究工作基础上,采用UPLC-Q-TOF/MS联用技术并结合多元统计分析方法,对中药五味子炮制前后物质基础的改变进行了分析,对五味子生品、醋品在大鼠体内的代谢排泄情况进行了系统的分析研究,并尝试通过代谢组学的方法揭示五味子醋制增强其抗肝损伤作用的内在机制。从化学成分、代谢谱、代谢组学相结合的外源性药物和内源性代谢物的角度共同探讨五味子醋制保肝的作用特点及机制。
韩棉梅[7]（2012）在《四磨汤口服液治疗肝郁气滞型IBS-C的疗效分析和机理研究》文中研究说明目的1观察四磨汤口服液对便秘型肠易激综合征（IBS-C）肝气郁滞型患者的临床症状、体征的影响；研究、评价四磨汤口服液治疗便秘型肠易激综合征的临床疗效；比较四磨汤口服液与经典促胃肠动力西药莫沙比利在改善（IBS-C）肝气郁滞型患者症状方面的优劣,为指导临床医师用药提供参考。2建立肝郁气滞证IBS-C大鼠模型,通过观察神经细胞突触可塑性的变化；检测中枢神经系统和肠神经系统两个部位中的神经递质的变化；研究脊髓、结肠中神经递质P物质、血管活性肠肽VIP在肝气郁滞型IBS-C发病中的作用和相互关系,探讨四磨汤口服液调整肠易激综合征的可能作用机理。方法1临床研究在2010年3月至2012年2月期间广州中医药大学第-附属医院岭南名医诊区和消化内科门诊,选择符合纳入标准的158例中医证属肝郁气滞的便秘型肠易激综合征患者,采用随机数字法分为治疗组80例和对照组78例。分别给予四磨汤口服液和莫沙必利分散片治疗,疗程2周,治疗前、后填写临床症状评分问卷调查,统计各个症状积分的前、后增减,对比分析四磨汤口服液和莫沙比利组治疗前、后各主要症状积分变化及采用尼莫地平法评价两中药物的临床疗效。2实验研究选用广东省动物实验中心的SPF级SD大鼠60只,体重180-220g,雌雄各半。普通饮食,适应性喂养1周后,进行实验。随机分为模型组、正常组、四磨汤低剂量组、中剂量组和高剂量组、莫沙必利组。正常组给予常规喂养、给水,其余各组进行造模。肝郁气滞证动物模型：夹尾法加饥饱失常法。造模7天,造模后模型组给予生理盐水2m1/次,1次/日,灌胃；低、中、高剂量组分别以相当于临床等效剂量2倍、4倍、8倍的四磨汤用量灌胃给药（1.5g/kg、3g/kg、6g/kg）,用药7天。给药结束后,行腹部回缩反射实验,统计大鼠台腹、拱背的压力阈值,评价IBS大鼠模型的成功与否。行胃排空及小肠推进实验,检测胃排空率及小肠推进率；透射电镜观察结肠ENS中突触的超微结构变化；运用RT-PCR检测与突触功能密切相关的突触素：mRNA的表达；通过放射免疫法和免疫组化法检测肠易激综合征大鼠脊髓及结肠神经递质VIP、 SP表达水平。结果1临床研究临床研究发现中药四磨汤口服液可以明显改善肝郁气滞证IBS-C的主要临床症状：四磨汤口服液在改善腹胀,腹痛,排便艰涩不畅,大便不爽,排便不尽感,嗳气,胸胁痞满症状均优于对照组,具有统计学差异。四磨汤口服液治疗便秘型肠易激综合征（IBS-C）肝郁气滞证总有效率达92.50%,明显优于对照组阳性药物莫沙比利的总有效率84.62%；中、西药组治疗后各症状较治疗前也有显着改善,但与治疗组治疗后比较,除在改善胃纳减少方面与治疗组无差异外,其它各症状的改善都不如治疗组疗效好（P<0.05）。2实验研究2.1模型后大鼠精神萎靡不振,活动减少,反应减慢,纳呆,进食量、饮水量减少,腹胀,皮毛枯黄无光泽,体重增加不明显,24h排便量减少,粪便变干,粪便含水率降低,与正常组相比有显着性差异（P<0.05）。模型组胃排空及小肠推进率较正常组明显减慢,（P<0.05）。经治疗后,上述症状较模型组有明显改善,24h大便颗粒数增多,含水率增高,胃排空和小肠推进增快。与模型组比较,四磨汤高、中、低剂量组和莫沙必利组胃排空率及小肠推进率均有显着性差异（P<0.01）四磨汤高剂量组与低剂量组相比较,有统计学差异（P<0.05）。2.2研究发现造模后大鼠结肠近端突触发生超微结构上的改变：突触囊泡数量显着增加,突触后膜电子致密物明显增厚,突触间隙变窄。这些变化：囊泡的数量的增加,PSD增厚和突触间隙的变窄,提示着囊泡释放几率增加,突触的传递效率增强。用中药四磨汤口服液高中低剂量、西药莫沙比利干预后的大鼠其结肠近端的突触突触囊泡数量较模型组减少,突触后膜电子致密物变薄,突触间隙变宽,这些变化提示这治疗后突触传递效率减低。运用荧光定量PCR的方法检测突触素（SPY）和突触后致密物质PSD-95的表达,结果提示：与正常组比较,模型组突触素（SYP）表达水平明显提高（P<0.01）。与模型组比较,四磨汤高剂量组和西药组均显着性降低。与正常组比较,模型组PSD-95mRNA表达水平明显提高（P<0.01）。与模型组比较,四磨汤高剂量组和西药组均显着性降低。2.3采用放免法和免疫组化法测定脊髓和结肠神经递质的变化,结果发现：模型组大鼠脊髓P物质较正常减少,两组见比较具有显着差异（P<0.01）；各组大鼠脊髓SP采用单因素方差分析分析进行数据统计,（F=2.051,P=.086）,四磨汤高剂量组与模型组相比,p=0.005,具有统计学差异；此外,其余各组比较均无统计学差异（P>0.05）,但就各组均数趋势而言,模型组大鼠脊髓SP含量水平较正常组有所降低,四磨汤低剂量组、四磨汤中剂量组、四磨汤高剂量组大鼠脊髓SP含量较模型组均有所增高,且呈计量相关。各组大鼠脊髓VIP采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析进行数据统计,（F=0.845,P=0.524）,各组间多重比较无统计学差异（P>0.05）模型组结肠肌间神经丛SP表达水平较正常组显着降低（P<0.01）,四磨汤高剂量组与莫沙必利组结肠肌间神经丛SP阳性表达较模型组增高（P<0.01）,但四磨汤中、低剂量组与模型组比较无统计学差异（P>0.05）,但有增高的趋势。模型组结肠肌间神经丛VIP表达水平较正常组显着增高（P<0.01）,四磨汤高剂量组与莫沙必利组结肠肌间神经丛VIP阳性表达较模型组明显降低(（P<0.01）,四磨汤中、低剂量组与模型组比较有统计学差异（P<0.01）。结论1.四磨汤口服液能够改善便秘型肠易激综合征肝气郁滞型患者的临床症状；2.四磨汤口服液能促进肠易激综合征模型大鼠胃排空和小肠推进；3.四磨汤能通过调节突触囊泡数量、突触间隙宽窄等来调节突触的传递效能,4.四磨汤口服液高剂量组大鼠的脊髓P物质升高,或许与四磨汤可能促进P物质的释放有关；四磨汤口服液能促进肠易激综合征模型大鼠近端结肠P物质的释放;5.四磨汤口服液对模型大鼠脊髓腰骶段抑制性神经递质VIP的释放无明显影响；四磨汤能抑制肠易激综合征模型大鼠近端结肠VIP的释放；6.调节结肠突触可塑性可能是四磨汤作用于肠易激综合征大鼠的关键。
杨平[8]（2012）在《鸡肠道Cajal间质细胞与肠神经系统的特性研究》文中认为新近的观点认为正常的肠道蠕动依赖于肠壁中肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS）、Cajal间质细胞（interstitial cells of cajal, ICC）和平滑肌细胞之间的相互作用。ICC是位于自主神经末梢和消化道平滑肌细胞之间的一类特殊的间质细胞,它在三个方面起作用：胃肠道平滑肌活动的起搏,推进电活动的传播和调节神经递质。以往关于ENS和ICC的研究主要集中在哺乳动物胃肠道。鸟类与哺乳动物的胃肠道在结构上存在一定差异性,同时,鸟类的肠神经系统不仅包括肠壁内的神经丛,还包括位于肠管外肠系膜缘的肠神经（又称Remak’s nerve）.这种差异是否导致ENS和ICC结构及其作用机制的不同?本研究以鸡作为试验动物,详细研究了鸡肠道内ICC的鉴定、分布以及与神经、平滑肌之间的联系,并对鸡NES中与ICC关系最为密切的NOS和AChE阳性神经元进行了胚后发育和分布比较研究。研究结果将从细胞和分子水平阐明鸡ENS和ICC的结构组成和相互联系,对揭示鸟类胃肠道功能有着重要意义,为鸟类胃肠动力学疾病治疗提供科学依据。试验I鸡肠道Cajal间质细胞的超微结构研究本试验应用透射电镜系统观察了鸡肠道Cajal间质细胞（interstitial cells of cajal, ICC）的超微结构特点,结果显示在鸡肠道的不同部位均有ICC的存在,分布密度不等。根据分布位置的不同可将ICC分为肌间ICC、肌内ICC、粘膜下层ICC、深肌层ICC和固有层ICC。电镜下,这些ICC具有共同的超微特征：存在大量的线粒体、丰富的中间丝；细胞核呈梭形或椭圆形,内含大量异染色质。ICC胞体呈梭形或星形,有数量不等的胞质突起,这些突起与周围平滑肌细胞和肠道神经形成密切联系。部分ICC也显示了平滑肌细胞的一些结构特点,如不连续的基底膜、胞膜小凹和致密体。ICC之间,以及ICC与邻近的平滑肌细胞之间存在着明显的缝隙连接样结构。与哺乳动物不同,鸡回肠固有层也分布有ICC。在鸡肠道组织中,成纤维细胞的分布也较为丰富,它们与ICC的主要区别在于其具有发达的分泌性细胞器,包括囊泡和不连续的基底膜,但缺乏中间丝和胞膜小凹。鸡肠道ICC的分布、超微结构特点及其与其它细胞的联系表明,ICC在鸡消化道动力学机制中发挥着重要的调控作用。ICC在粘膜固有层的分布,提示鸡肠道ICC可能比哺乳类具有更多的亚型。试验Ⅱ鸡肠道的C-kit阳性细胞表达与分布由于缺乏合适的标记物,Cajal间质细胞（interstitial cells of cajal, ICC）在禽类肠道的分布未见资料报道,本试验在第三章对鸡肠道ICC超微结构鉴定的基础上,应用合成的三相探针通过原位杂交方法,检测ICC的标记物c-kit mRNA在鸡肠道不同区域的分布规律；同时,应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）分别对不同肠段粘膜组织和去粘膜肠壁组织的c-kit mRNA表达进行测定。原位杂交结果显示出两种类型的c-kit mRNA阳性细胞。第一种为纺锤形或星极细胞组成,主要位于内环形肌和外纵形肌之间的肌间层,粘膜下层、环形肌和纵形肌内也有发现。这种类型的细胞被界定为ICC。进一步根据此类细胞分布位置不同可分为肌间ICC、肌内ICC和粘膜下ICC三种,而且不同肠段内阳性细胞数目也不相同。第二种为圆形或颗粒型细胞组成,主要位于粘膜固有层内,粘膜下层也有少量发现,这类细胞被界定为肥大细胞,主要分布于回肠和空肠。RT-PCR结果显示在不同肠段均有c-kit mRNA的表达：在去粘膜肠壁组织中,回肠和结肠表达最高,空肠和十二指肠次之,盲肠最低；而在粘膜组织中,空肠表达最高,十二指肠和回肠其次,结肠和盲肠最低。实验结果揭示了鸡肠道ICC的分布模式,显示了鸡肠道不同部位中c-kitmRNA表达差异,这种差异可能与不同肠段的功能及其调节方式有关。试验Ⅲ不同日龄鸡肠道c-kit与其配体SCF mRNA的表达研究本试验以β-actin为内参,采用SYBR染料法的实时荧光定量PCR （RT-PCR）技术。选取第1、10、20和40日龄三黄鸡去除粘膜后的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠肠壁中c-kit及其配体SCF mRNA的表达进行相对定量,初步阐明正常鸡肠道中c-kit及其配体SCF的mRNA表达量随着日龄变化的规律。结果显示所有肠段中c-kit mRNA的表达量从1日龄至40日龄逐渐降低,至20日龄时c-kit mRNA表达极显着低于1日龄。SCFmRNA的表达量从1日龄至10日龄逐渐升高,10日龄时mRNA表达最高,之后慢慢下降,至20日龄时的SCF mRNA表达显着低于10日龄。各肠段在不同日龄的c-kit和SCF mRNA表达量的变化表现如下：1日龄时,结肠中c-kit mRNA表达量最高,回肠最低；十二指肠中SCF mRNA表达量最高,盲肠最低。10日龄时,结肠中c-kit mRNA表达量最高,空肠最低；结肠中SCF mRNA表达量最高,盲肠最低。20至40日龄时,变化趋于稳定,都是回肠中c-kit和SCF mRNA表达量最高,盲肠最低。结果表明鸡肠道的胚后发育和功能形成是一个逐渐成熟的过程,而且c-kit及其配体SCF之间存在着密切的联系。试验Ⅳ鸡肠道Vimentin与NSE免疫荧光双标研究本试验采用ICC的标记物之一波形蛋白（vimentin）和神经元的特异标记物神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific Enolase, NSE）,对肠道切片进行免疫细胞化学双标,观察鸡不同肠段内vimentin、NSE阳性细胞的分布特征,探究ICC与神经之间的联系。结果发现：vimentin阳性细胞及其突起主要分布在肌层、粘膜下层和固有膜内,特别是在内环形肌和外纵形肌之间的肌间层大量出现。阳性细胞在大肠与小肠的肌内分布稍有区别,前者主要见于肌间隔内,而后者主要见于肌束内。大部分NSE阳性细胞分布于肌间层和粘膜下层,肌层内有零散分布；固有膜NSE阳性细胞量较少,但小肠固有膜vimentin阳性细胞明显多于大肠。粘膜上皮附近也能观察到。通过双标观察,肠道肌间和粘膜下层vimentin阳性细胞紧密围绕在NSE阳性细胞周围。固有膜内vimentin阳性细胞也多位于NSE阳性细胞周围。表明鸡vimentin细胞与NSE阳性细胞在肠道各段呈交错分布,两者关系紧密,提示它们在肠道活动中存在一定调节关系。试验V鸡肠道肌间层NOS阳性神经元胚后发育的结构研究肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS）的正常发育对了解肠道功能是非常重要的。鸡胚是研究肌间神经丛发育和ENS功能的理想模型,但关于鸡胚后肌间神经丛的发育未见报道。本研究的目的是定性和定量分析胚后发育期间鸡肌间神经丛NOS阳性神经元（即氮能神经元）的形态和分布。分别对7日龄、15日龄和成年鸡不同肠段（十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）进行肌间铺片制作,还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶（NADPH-d）组织化学反应后,利用IPP6.0软件对阳性神经元和神经节进行定量分析。结果显示NOS阳性神经元和神经纤维形成典型的三级网状结构,NOS阳性神经元形态各异,聚集在一起构成大小不等的神经节。NOS阳性神经元反应强度存在一定差异,数个阳性神经元经常可形成串珠形和U形结构。NOS阳性神经元和神经节的密度随着年龄的增长而降低,但神经节中的阳性神经元的数量却有所增加。在所有年龄组中,NOS阳性神经元数量在结肠最高,随后是回肠,空肠,十二指肠和盲肠。结果表明,鸡肠道肌间神经丛存在胚后发育现象,提示鸡ENS功能形成是一个逐渐成熟和完善的过程；另外在每个肠段之间的发育并无明显差异,提示不同肠段的功能执行在出生后就已确定。试验Ⅵ鸡回肠粘膜下层胆碱能神经元的胚后发育研究乙酰胆碱能神经元释放的乙酰胆碱（ACh）是胃肠道最主要的兴奋性神经递质,能刺激平滑肌收缩,增强胃肠道分泌,促进肠道激素的释放。本研究分别制作0、5、10、20、40日龄三黄鸡回肠粘膜下层铺片样品,通过乙酰胆碱酯酶（AChE）组织化学反应,探究0日龄到40日龄鸡肠道粘膜下神经丛胆碱能神经元的构筑及其变化。结果显示AChE阳性神经元和神经纤维形成立体的三级网状结构,AChE阳性神经元形态各异,聚集在一起构成大小不等的神经节。随着年龄的增长神经节密度明显降低,直到40日龄组。相反,神经节中神经元大小逐渐增加,40日龄组中几乎是0日龄组的3倍。在胚后发育初期,每个神经节中的神经元数量从10日龄起,基本呈现稳定上升的趋势。鸡回肠粘膜下神经丛胚后发育变化的研究结果,将为鸡的肠神经系统失调引起的胃肠道疾病诊断提供重要的病理组织学参考。试验Ⅶ鸡回肠段胆碱能和氮能神经元的组织化学定位分别制作鸡回肠冰冻切片、肌间和粘膜下层铺片,应用乙酰胆碱酯酶（AChE）和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶（NADPH-d）组织化学反应,分别对胆碱能和氮能神经元进行定位分析。冰冻切片结果显示AChE和NADPH-d阳性反应广泛分布于神经元胞体和神经纤维中。阳性神经元呈不规则或多边形,主要在肌间和粘膜下层零星或成簇出现,肌内也有一定的分布。肌间阳性神经纤维可明显插入环形肌内,阳性神经纤维经常围绕在血管周围,也有一些阳性神经纤维从肌层发出,穿过粘膜下层进入粘膜固有层,并且渗透到肠绒毛上皮下；肌内和粘膜中的AChE神经纤维的数量远超过NADPH-d阳性神经元和神经纤维。铺片结果显示AChE和NADPH-d阳性神经元位于神经节中,神经节之间通过阳性纤维相连形成致密的网络样结构,粘膜下网络明显比肌间密集,粘膜下神经节密度远大于肌间,但粘膜下每个神经节中的神经元数目要远小于肌间,粘膜下层神经元的大小也较肌间的小。AChE阳性神经元数目要远多于NADPH-d阳性神经元数目。结果表明鸡回肠广泛分布有兴奋性的胆碱能和抑制性的氮能神经元,可能在胃肠道功能调节中发挥重要作用。
李力燕[9]（2007）在《人胚胎脊髓发育过程中NTs家族及其受体的表达及变化》文中研究说明目的探讨神经营养素家族及其受体与人胚胎脊髓发育的关系。方法应用免疫组织化学、原位杂交、蛋白质印迹和逆转录酶多聚酶链反应等方法系统研究神经营养素家族及其受体在人胚胎3w～8m脊髓内的表达及变化。结果1．NGF蛋白在3w末和4w的神经管上皮中已有表达，在5～7w，随胚胎发育在套层、基板、翼板的神经细胞前体表达，阳性反应随胚龄增加。8～9w，套层大量的阳性细胞，翼板较基板更为密集。逐渐出现分化中的各种形态的成神经细胞。3m后，阳性细胞密度下降，但灰质内可见形态逐渐趋于成熟的神经细胞，数量逐渐增加。6m后脊髓形态趋于成体化，灰质内阳性神经细胞的形态更趋典型。6w时边缘层可见阳性纤维，3m时白质内可见少量阳性胶质细胞，6m时增多。通常胶质细胞的分化晚于神经细胞，白质内阳性纤维的出现早于胶质细胞；Western blotting蛋白定量分析显示：6～8w，蛋白含量随胚龄逐渐增加，8、9w时达到高峰（P＜0.05），3m后下降（P＜0.05），6m后又有所增加，并保持相对平稳。蛋白含量测定的结果与免疫组化定位表达的变化相吻合；原位杂交显示NGFmRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性，晚于蛋白表达出现的时间。之后随脊髓的发育，阳性表达增加，至8w、9w时，可见分化中各种形态的成神经细胞，3m时，细胞密度下降。至4m时，可见阳性的多极神经元。6～8m，阳性神经细胞形态更趋成熟。白质内纤维和胶质细胞的阳性反应晚于神经细胞，表达模式与NGF蛋白的相似；RT-PCR的结果显示，NGFmRNA的表达在6～8w是逐渐上调的，8w时达到峰值（P＜0.05），从第9w后表达下调，在第4m时下调到最低值（P＜0.05），以后又逐渐上调。NGFmRNA含量测定的结果与原位杂交定位表达的变化相吻合；2．TrkA蛋白在3w末4w的神经管上皮、内界膜表达阳性，5～7w随神经管的发育相继在套层、基板、翼板的部分细胞胞浆表达，8～9w，套层阳性细胞密集，翼板较基板更多，细胞核膜和核仁明显，逐渐出现分化中的各种形态的阳性成神经细胞。10w～3m，多突起的大神经元逐渐增多，白质内胶质细胞阳性。4～5m，背角、腹角内较多阳性神经元，白质内可见阳性胶质细胞和纤维。6m后趋于成熟；Western blotting显示：TrkA蛋白在6w已有一定的含量，但比较低，6w到3m之间含量缓慢增加，4m时明显增加（P＜0.05），5m，含量有所下降，7m略有升高。与免疫组化定位表达的变化基本吻合：原位杂交显示TrkAmRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性，晚于蛋白表达出现的时间。之后相继在套层、基板、翼板表达，阳性反应逐渐增加，阳性神经细胞从以幼稚的无极成神经细胞为主转为以多种形态为主，9w可见少数多极成神经细胞，3～4m逐渐增多，并渐趋成熟。表达模式与TrkA蛋白的相似：RT-PCR的结果显示：9w起可检测到TrkAmRNA的表达，3m时达到最高（P＜0.05），从4m时开始下调，但幅度不大；3．BDNF蛋白在3w末4w的神经管内界膜、外界膜表达，阳性反应较强，随脊髓的发育，BDNF表达的部位与NGF的相似，但早期在神经上皮细胞突起的表达较为明显，晚期，在6m时除在灰质内见到各种形态的神经细胞外，还可见深染的白质纤维束；Western blotting显示：BDNF蛋白含量测定的结果与免疫组化定位表达的变化基本相吻合，变化曲线与NGF的相似；原位杂交显示BDNFmRNA在3w末4w的神经管上皮即有明显表达，表达模式与蛋白的相似，阳性反应较NGF强；BDNFmRNA含量测定的结果与原位杂交定位表达的变化相吻合；4．免疫组化显示TrkB蛋白在5w时的神经管内界膜、神经上皮和套层呈弱阳性反应，之后在发育中脊髓的表达部位与BDNF蛋白的相似，但阳性反应明显弱于BDNF；蛋白定量显示：TrkB从第6w至4m呈现逐渐上调的趋势，但未见明显上调的时间段，4m后下调，6m后略有上调，总体水平很低。与免疫组化定位表达的变化相吻合；原位杂交显示TrkBmRNA在5w的神经管有表达，表达模式与TrkB蛋白的表达相似。RT-PCR结果显示，早期TrkBmRNA随发育逐渐上调，8w时达到峰值，从9w开始表达下调，类似于BDNF的变化；5．NT-3蛋白的表达很具特征性，阳性表达以细胞突起和纤维最为突出。NT-3在第3、4w的神经管上皮即呈强阳性反应，各期细胞的阳性突起呈放射状，5～8w，神经上皮层及套层大量放射状纤维，8～11w，阳性神经细胞前体也较丰富。阳性反应出现的部位与NGF和BDNF相似；Westernblotting分析显示：NT-3从第6w开始即达一定水平，并且逐渐上升到第9周达峰值（P＜0.05），之后下降并维持在一定水平，与定位表达的变化吻合；原位杂交显示NT-3mRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性反应，晚于蛋白的表达，且阳性弱。表达模式与蛋白的相似，但在细胞突起内的表达不如蛋白的突出；RT-PCR的结果显示，NT-3mRNA的变化与定位的表达变化相吻合；6．免疫组化定位表达显示TrkC蛋白在3w末的神经管内界膜呈弱阳性反应，表达模式与NT-3相似，但在细胞突起内的表达不如NT-3那么突出，但较其它两种受体TrkA和TrkB的明显；Western blotting的测定结果与定位表达的变化相符；TrkCmRNA的定位表达：在4w的神经上皮部分细胞表达，5w起其表达部位与TrkC蛋白的相似，但阳性较弱；RT-PCR结果显示：TrkCmRNA含量的变化与定位表达的相符；7．NT-4蛋白在3w末的神经管上皮呈弱阳性反应，表达模式与NGF、BDNF相似，但6m时，腹角神经元非常明显，中间带、后角各板层均可见阳性神经元。白质的后索、外侧索比前索的阳性胶质细胞多：Western blotting结果显示：NT-4于第6w已存在，之后缓慢升高到第8w后快速增加，第9w达高峰（P＜0.05），以后又缓慢下降，第5、6m在一定水平保持平稳。NT-4蛋白含量的变化基本与免疫组化显示的形态学变化一致；NT-4mRNA的定位表达于4w的神经管上皮可见，其表达模式与蛋白的相似；RT-PCR的实验结果显示，NT-4mRNA含量的变化基本与原位杂交显示的形态学变化相似；8．在检测时段内，神经管上皮不同细胞周期的室细胞或室管膜上皮细胞始终有部分表达各种因子。结论1．神经营养素家族各因子（NGF、BDNF、NT-3、NT-4）广泛分布于人胚胎脊髓发育各个时期的各种结构中，并且在早期脊髓的表达更强，各因子的表达既有重叠又有差异，提示神经营养素家族在人胚胎脊髓发育的各个阶段特别是胚期脊髓的发育中发挥着重要的作用，但在不同的区域和细胞又各自发挥着不同的作用；2．神经营养素家族各因子的mRNA广泛地存在于各个发育时期神经细胞和胶质细胞中，提示胚胎发育时期，神经管或脊髓的神经细胞和胶质细胞具有自身合成神经营养素的功能；3．神经营养素家族的高亲和受体广泛分布在人胚胎发育的各个时期的神经细胞和胶质细胞，提示人胚胎脊髓发育时期神经营养素家族各因子还可通过自分泌和旁分泌方式发挥其各种生理功能；4．神经营养素家族可能具有诱导脊髓室管膜上皮神经干细胞分裂增殖的能力。
郭建辉,王廷华,李力燕[10]（2005）在《神经激肽A在大鼠胃发育中的定性定量分析》文中研究表明本研究用免疫组织化学PAP法和图像分析系统研究大鼠胚胎13d至成年胃中神经激肽A（NKA）的表达及变化。结果显示:胚胎14d,胃的肌间丛出现NKA免疫阳性反应,随发育相继在环肌、纵肌、粘膜下层、固有膜、粘膜肌及粘膜丛内出现NKA的表达,生后30d时NKA在胃的表达已具备成年鼠的分布特征。结果提示, （1）NKA在胃的表达变化主要在生前1周生后4周内,其表达变化有两个关键时期,即生前1周生后1周和生后1月末; （2）NKA对大鼠胃的发育可能具有重要的作用,可能与胃功能的建立密切相关。
二、神经激肽A在大鼠结肠发育中的定性定量分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经激肽A在大鼠结肠发育中的定性定量分析（论文提纲范文）
（1）肛门直肠畸形大鼠盆底肌发育异常的分子机制及其宫内移植干细胞修复作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :先天性肛门直肠畸形大鼠胚胎盆底横纹肌复合体转录组对比研究 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肛门直肠畸形动物模型制作及标本制备 |
| 2.2.2 高通量测序 |
| 2.2.3 运用RT-q PCR技术验证RNA-Seq筛查结果 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胎鼠标本的大体观察结果和分组收集情况 |
| 3.2 RNA-Seq预测差异表达RNA |
| 3.2.1 RNA-Seq中差异表达的m RNA信息与分析 |
| 3.2.2 RNA-Seq中差异表达的lnc RNA信息与分析 |
| 3.2.3 RNA-Seq中差异表达的circ RNA信息与分析 |
| 3.2.4 差异基因蛋白相互作用网络分析 |
| 3.3 RT-q PCR验证部分RNA-Seq筛查结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :Wnt信号通路相关分子在肛门直肠畸形大鼠盆底横纹肌复合体发育中表达规律研究 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 主要试剂和仪器 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 主要实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 肛门直肠畸形动物模型制作及标本制备 |
| 7.2.2 石蜡切片 |
| 7.2.3 RT-q PCR检测对照组和ARMs组 SMC组织中目的基因m RNA的表达水平 |
| 7.2.4 Western blot检测对照组和ARMs组 SMC组织中目的蛋白的表达水平 |
| 7.2.5 免疫组织化学染色检测对照组和 ARMs 组 SMC 组织中目的蛋白含量的变化 |
| 7.2.6 统计学分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 胎鼠标本的大体观察结果和分组收集情况 |
| 8.2 RT-q PCR检测对照组和ARMs组 SMC组织中Wnt7a、β-catenin、Bmp2 和Ckap4 基因m RNA的表达 |
| 8.3 Western blot检测对照组和ARMs组 SMC组织中WNT7A、 β-catenin和BMP2基因蛋白的表达 |
| 8.4 Western blot检测对照组和ARMs组 SMC组织中Wnt通路下游靶蛋白表达水平的验证 |
| 8.5 免疫组织化学染色检测对照组和ARMs组 SMC组织中WNT7A、β-catenin和BMP2基因蛋白的表达 |
| 8.6 免疫组织化学染色检测对照组和ARMs组 SMC组织中Wnt通路下游靶蛋白表达水平的验证 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分 :lnc RNA及其靶向作用蛋白在肛门直肠畸形大鼠盆底横纹肌复合体发育中表达规律研究 |
| 11 前言 |
| 12 材料与方法 |
| 12.1 主要试剂和仪器 |
| 12.1.1 主要试剂 |
| 12.1.2 主要实验仪器 |
| 12.2 实验方法 |
| 12.2.1 肛门直肠畸形动物模型制作及标本制备 |
| 12.2.2 lnc RNA-mi RNA-m RNA靶向作用网络分析 |
| 12.2.3 RT-q PCR检测对照组和ARMs组 SMC组织中TCONS_00051629、TCONS_00028283及其下游靶分子的表达 |
| 12.2.4 Western blot检测对照组和ARMs组 SMC组织中SYT7、RETN和DKK3蛋白的表达水平 |
| 12.2.5 免疫组织化学染色检测对照组和ARMs组SMC组织中SYT7、RETN和DKK3蛋白的表达水平 |
| 12.2.6 双萤光素酶报告基因检测实验 |
| 12.2.7 统计学分析 |
| 13 结果 |
| 13.1 胎鼠标本的大体观察结果和分组收集情况 |
| 13.2 lnc RNA-mi RNA-m RNA靶向作用网络分析图 |
| 13.3 RT-q PCR检测对照组和ARMs组 SMC组织中TCONS_00051629、TCONS_00028283及其下游靶分子的表达 |
| 13.4 Western blot检测对照组和ARMs组 SMC组织中SYT7、RETN和DKK#3蛋白的表达水平 |
| 13.5 免疫组织化学染色检测对照组和ARMs组 SMC组织中SYT7、RETN和DKK3蛋白的表达水平 |
| 13.6 双萤光素酶报告基因检测 |
| 13.6.1 双萤光素酶报告基因检测实验验证TCONS_00051629—rno-mi R-326-3p—Retn靶向调控关系 |
| 13.6.2 双萤光素酶报告基因检测实验验证TCONS_00051629—rno-mi R-330-5p—Retn靶向调控关系 |
| 13.6.3 双萤光素酶报告基因检测实验验证TCONS_00028283—rno-mi R-193a-5p—Dkk3 靶向调控关系 |
| 13.6.4 双萤光素酶报告基因检测实验验证rno-mi R-328a-3p—Dkk3 靶向调控关系 |
| 13.6.5 双萤光素酶报告基因检测实验验证rno-mi R-3584-5p—Dkk3 靶向调控关系 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 第四部分 :子宫内肌源性干细胞及成肌细胞系移植修复发育不良的盆底横纹肌复合体的实验研究 |
| 16 前言 |
| 17 材料方法 |
| 17.1 主要试剂和仪器 |
| 17.1.1 主要试剂 |
| 17.1.2 主要仪器 |
| 17.2 实验方法 |
| 17.2.1 肌源性干细胞分离 |
| 17.2.2 MDSCs的鉴定 |
| 17.2.3 肌源性干细胞和成肌细胞系的培养 |
| 17.2.4 腺病毒转染 |
| 17.2.5 胎儿手术和显微镜下注射 |
| 17.2.6 新生畸形鼠显微造瘘手术及术后护理 |
| 17.2.7 移植后存活细胞观察和计数 |
| 17.2.8 移植后分化鉴定 |
| 17.2.9 统计学处理 |
| 18 结果 |
| 18.1 肌源性干细胞的体外培养、鉴定及转染 |
| 18.2 移植肌源性干细胞在ARMs胎鼠盆底肌区域的存活情况 |
| 18.3 移植的肌源性干细胞在ARMs胎鼠SMC区域的分化情况 |
| 19 讨论 |
| 20 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心肌致密化不全的研究背景与意义 |
| 1.1.1 心肌致密化不全的研究背景 |
| 1.1.2 维甲酸在心肌发育中关键的生理病理机制 |
| 1.1.3 心肌致密化不全基础研究的意义 |
| 1.2 心肌致密化不全的国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 心肌致密化不全的发现和命名 |
| 1.2.2 心肌致密化不全的流行病学调查 |
| 1.2.3 心肌致密化不全的分类 |
| 1.2.4 心肌致密化不全的病因和发病机制 |
| 1.2.5 心肌致密化不全的病理解剖学 |
| 1.2.6 心肌致密化不全的病理生理学和临床表现 |
| 1.2.7 心肌致密化不全的临床诊断与鉴别诊断 |
| 1.2.7.1 心肌致密化不全的临床诊断 |
| 1.2.7.2 心肌致密化不全的鉴别诊断 |
| 1.2.8 心肌致密化不全的治疗 |
| 1.2.9 心肌致密化不全的疗效与预后 |
| 1.2.10 心肌致密化不全的动物模型研究现状 |
| 1.2.11 心肌致密化不全基础和临床研究存在的问题 |
| 1.2.12 心肌致密化不全的基础和临床研究展望 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 建立心肌致密化不全动物模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验小鼠 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 心肌致密化不全小鼠模型给药前准备 |
| 2.3.2 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 2.3.3 心肌致密化不全小鼠模型组织收集和组织病理学染色 |
| 2.3.4 幼鼠心脏组织诊断标准与显微镜下观察 |
| 2.3.5 心肌致密化不全小鼠模型实验数据统计学分析 |
| 2.4 心肌致密化不全小鼠模型实验结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠合笼后交配情况统计与分析 |
| 2.4.2 小鼠合笼后交配后怀孕情况统计与分析 |
| 2.4.3 RA干预组与对照组孕鼠生产情况统计与分析 |
| 2.4.4 RA干预组与对照组出生幼鼠体重统计与分析 |
| 2.4.5 RA干预组与对照组母鼠体重统计与分析 |
| 2.4.6 心肌致密化不全心脏病理学结果与分析 |
| 2.5 心肌致密化不全小鼠模型建立技术路线 |
| 2.6 本章讨论和结论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 TMT相对定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 实验小鼠 |
| 3.2.3 心肌致密化不全小鼠模型药物干预前准备 |
| 3.2.4 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 3.2.5 心肌致密化不全小鼠模型心脏组织样品收集 |
| 3.2.5.1 RA干预组与对照组孕鼠及剖腹后幼鼠情况统计与分析 |
| 3.2.5.2 RA干预组与对照组幼鼠心脏组织样品收集与保存 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 3.3.2 小鼠心脏组织样品TMT标记 |
| 3.3.2.1 样品蛋白组TMT分析预实验 |
| 3.3.2.2 蛋白组TMT分析正式实验 |
| 3.3.3 肽段分级 |
| 3.3.4 液相色谱串联质谱法数据采集 |
| 3.3.5 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.6.1 GO功能注释 |
| 3.3.6.2 KEGG通路注释 |
| 3.3.6.3 GO注释和KEGG注释的富集分析 |
| 3.3.6.4 蛋白质聚类分析 |
| 3.3.6.5 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.4 TMT定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白结果分析 |
| 3.4.1 主要结果和结论 |
| 3.4.2 实验和生物信息学分析结果 |
| 3.4.2.1 蛋白质鉴定结果汇总 |
| 3.4.2.2 差异表达蛋白质筛选 |
| 3.4.2.3 差异表达蛋白质聚类分析 |
| 3.4.2.4 差异表达蛋白质GO功能富集分析 |
| 3.4.2.5 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析 |
| 3.4.2.6 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.5 附件 |
| 3.5.1 质量控制 |
| 3.5.1.1 肽段离子质量偏差分布 |
| 3.5.1.2 肽段离子得分分布 |
| 3.5.1.3 蛋白质丰度比分布 |
| 3.5.2 鉴定蛋白质和肽段特性 |
| 3.5.2.1 蛋白质相对分子质量分布 |
| 3.5.2.2 蛋白质等电点分布 |
| 3.5.2.3 肽段序列长度分布 |
| 3.5.2.4 肽段序列覆盖度 |
| 3.5.2.5 鉴定肽段数量分布 |
| 3.5.3 数据库介绍 |
| 3.5.3.1 NR数据库 |
| 3.5.3.2 UniProt数据库 |
| 3.5.3.3 GO数据库 |
| 3.5.3.4 KEGG通路数据库 |
| 3.5.3.5 STRING数据库 |
| 3.6 TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织技术路线 |
| 3.7 实验结果和讨论 |
| 3.7.1 能量代谢讨论 |
| 3.7.2 凝血功能讨论 |
| 3.8 本章小结 |
| 第四章 PRM技术验证和定量分析心肌致密化不全差异蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 项目样品基本信息 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白提取 |
| 4.3.2 蛋白酶解 |
| 4.3.3 液相色谱平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.3.3.1 高效液相色谱分析 |
| 4.3.3.2 高分辨平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 目标肽段PRM检测结果分析 |
| 4.4.2 差异蛋白表达量分析 |
| 4.4.3 实验结果与结论 |
| 4.5 差异蛋白结构及功能的讨论及分析 |
| 4.5.1 激肽原1结构与功能 |
| 4.5.2 α1抗胰蛋白酶结构与功能 |
| 4.5.3 载脂蛋白AI结构与功能 |
| 4.5.4 β2糖蛋白1结构与功能 |
| 4.5.5 微管蛋白β4α链结构与功能 |
| 4.5.6 通道蛋白4结构与功能 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 5.2.1 针对本实验不足的补充研究 |
| 5.2.2 针对本研究后续的工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（3）硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 现代医学对慢传输型便秘的认识 |
| 1.1 概念 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 病因与病机 |
| 1.3.1 精神心理因素 |
| 1.3.2 生活习惯因素 |
| 1.3.3 结肠平滑肌损伤 |
| 1.3.4 肠神经系统异常 |
| 1.3.5 神经递质紊乱 |
| 1.3.6 Cajal间质细胞病变 |
| 1.4 临床治疗 |
| 2 慢传输型便秘与结肠细胞自噬及凋亡 |
| 2.1 肠神经系统网络结构损伤是慢传输型便秘主要病理表现 |
| 2.2 结肠细胞自噬影响肠神经系统网络结构形态功能 |
| 2.3 结肠细胞凋亡影响肠神经系统网络结构形态功能 |
| 2.4 自噬与凋亡的关系 |
| 3 中医学对慢传输型便秘的认识 |
| 3.1 病名源流 |
| 3.2 病因病机 |
| 3.2.1 病因 |
| 3.2.1.1 感受外邪 |
| 3.2.1.2 饮食不节 |
| 3.2.1.3 情志不畅 |
| 3.2.1.4 年老体虚 |
| 3.2.1.5 瘀血阻滞 |
| 3.2.2 病机 |
| 3.2.2.1 津液不足 |
| 3.2.2.2 气机郁滞 |
| 3.2.2.3 阳虚寒凝 |
| 3.2.2.4 气血亏虚 |
| 3.2.2.5 阴阳失调 |
| 3.3 辨证论治 |
| 3.3.1 六经辨证论治 |
| 3.3.2 八纲辨证论治 |
| 3.3.3 气血津液辨证论治 |
| 3.3.4 脏腑辨证论治 |
| 3.3.4.1 从肺论治 |
| 3.3.4.2 从脾胃论治 |
| 3.3.4.3 从肝论治 |
| 3.3.4.4 从肾论治便秘 |
| 4 分析与总结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 STC大鼠模型的复制及过程中结肠细胞自噬与凋亡的变化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及制备 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 模型建立及评估方法 |
| 2.1.1 模型建立 |
| 2.1.2 模型评估 |
| 2.2 标本采集方法 |
| 2.3 指标观察方法 |
| 2.3.1 病理形态学观察 |
| 2.3.2 肌间神经丛铺片制作方法 |
| 2.3.3 透射电镜标本制作方法 |
| 2.3.4 TUNEL法检测结肠肌层凋亡细胞指数 |
| 2.3.5 Western bolt检测结肠肌层PGP9.5、c-kit、Cx43、Sy、Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3 蛋白表达的方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 一般情况的变化 |
| 3.2 首粒黑便排出时间的变化 |
| 3.3 24h便量的变化 |
| 3.4 结肠组织病理形态变化 |
| 3.5 肌间神经丛形态的变化 |
| 3.6 肠神经系统网络结构的变化 |
| 3.6.1 肠神经系统网络超微结构的变化 |
| 3.6.2 肠神经系统网络结构相关蛋白的表达变化 |
| 3.7 自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62 的表达变化 |
| 3.8 结肠肌层细胞凋亡变化 |
| 3.8.1 TUNEL法检测结肠肌层细胞凋亡变化 |
| 3.8.2 凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 的表达变化 |
| 4 分析与小结 |
| 4.1 模型成功判断 |
| 4.2 造模过程中结肠形态及肠神经系统网络结构变化 |
| 4.3 造模过程中细胞自噬变化 |
| 4.4 造模过程中细胞凋亡变化 |
| 4.5 造模过程中肠神经系统网络结构损伤与自噬及凋亡关系 |
| 实验二 硝菔通结方对STC模型大鼠肠动力及肠神经系统网络结构的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及制备 |
| 1.2.1 硝菔通结方组成 |
| 1.2.2 药物煎煮方法 |
| 1.3 实验主要试剂及器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及给药方法 |
| 2.1.1 动物分组方法 |
| 2.1.2 造模及给药方法 |
| 2.2 标本采集方法 |
| 2.3 指标检测方法 |
| 2.3.1 一般行为学观察及体质量 |
| 2.3.2 首粒黑便观测方法 |
| 2.3.3 结肠肌电检测方法 |
| 2.3.4 病理形态学观察 |
| 2.3.5 肌间神经丛铺片制作方法 |
| 2.3.6 透射电镜标本制作方法 |
| 2.3.7 免疫荧光检测结肠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 方法 |
| 2.3.8 Western bolt检测结肠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 蛋白表达的方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 对一般行为学及体质量的影响 |
| 3.2 对首粒黑便排出时间的影响 |
| 3.3 对24 小时便量的影响 |
| 3.4 对在体结肠肌电的影响 |
| 3.5 对结肠组织病理形态的影响 |
| 3.6 对肌间神经丛的影响 |
| 3.7 对肠神经系统网络超微结构的影响 |
| 3.8 对结肠肠神经系统网络结构相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.8.1 免疫荧光法检测PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 表达水平 |
| 3.8.2 Western Blot法检测结肠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 蛋白表达水平 |
| 4 分析与小结 |
| 4.1 硝菔通结方对STC大鼠一般情况的影响 |
| 4.2 硝菔通结方对STC大鼠便秘症状的影响 |
| 4.3 硝菔通结方对STC大鼠结肠肌电的影响 |
| 4.4 硝菔通结方对STC大鼠肠神经系统网络结构的影响 |
| 实验三 硝菔通结方对STC模型大鼠结肠细胞自噬与凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品及制备 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及给药方法 |
| 2.2 标本采集方法 |
| 2.3 指标检测方法 |
| 2.3.1 免疫荧光检测Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、mTOR方法 |
| 2.3.2 Western Blot检测结肠组织Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、p-mTOR、mTOR蛋白表达的方法 |
| 2.3.3 RT-PCR法检测检测结肠组织Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3 mRNA表达的方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 硝菔通结方对结肠自噬相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.1.1 免疫荧光法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62 表达水平 |
| 3.1.2 Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62 表达水平 |
| 3.1.3 RT-PCR法观察结肠自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62mRNA表达水平 |
| 3.2 硝菔通结方对结肠凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 表达水平的影响 |
| 3.2.1 免疫荧光法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 表达水平 |
| 3.2.2 Western Blot法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 表达水平 |
| 3.2.3 RT-PCR法观察结肠肌层凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 mRNA表达水平 |
| 3.3 硝菔通结方对结肠mTOR表达水平的影响 |
| 3.3.1 免疫荧光法观察结肠组织mTOR的表达水平 |
| 3.3.2 Western Blot法观察结肠肌层p-mTOR的表达水平 |
| 4 分析与小结 |
| 4.1 硝菔通结方对自噬相关蛋白的影响 |
| 4.2 硝菔通结方对凋亡相关蛋白的影响 |
| 4.3 硝菔通结方对mTOR的影响 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 大黄灌胃复制慢传输型便秘模型的选择 |
| 2 肠神经系统网络结构损伤与自噬及凋亡变化的探讨 |
| 2.1 肠神经系统网络结构损伤的探讨 |
| 2.2 自噬变化的探讨 |
| 2.3 凋亡变化的探讨 |
| 2.4 自噬、凋亡与肠神经系统网络结构损伤关系的探讨 |
| 3 硝菔通结方治疗慢传输型便秘的理论依据 |
| 3.1 补肾益精法是治疗慢传输型便秘的常用治法 |
| 3.2 硝菔通结方是补肾益精,润肠通便的有效方剂 |
| 3.3 硝菔通结方单味药物分析 |
| 4 对照药物的选择 |
| 5 硝菔通结方治疗慢传输型便秘作用探讨 |
| 5.1 硝菔通结方对STC大鼠一般情况的影响 |
| 5.2 硝菔通结方对STC大鼠便秘症状的影响 |
| 5.3 硝菔通结方对STC大鼠结肠肌电的影响 |
| 5.4 硝菔通结方对STC大鼠结肠病理形态的影响 |
| 5.5 硝菔通结方对STC大鼠肠神经系统网络结构的影响 |
| 5.6 硝菔通结方对STC大鼠结肠细胞自噬与凋亡的影响 |
| 6 补肾益精法作用探讨 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 WIRS诱导AGML和DRG、胃组织和胃黏膜中TRPA1和SP表达上调 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 第二部分 HC-030031有效减轻WIRS诱导的AGML和抑制DRG、胃组织和胃黏膜中SP的释放 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 第三部分 AITC诱导AGML和DRG、胃组织和胃黏膜中SP释放 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 综述一、瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1) |
| 参考文献 |
| 综述二、P物质（Substance P，SP） |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及参与科研工作 |
| 致谢 |
（5）“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠Th17/Treg及肠道菌群的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肺与大肠相表里理论的研究进展 |
| 1 “肺与大肠相表里”的理论内涵 |
| 2 肺与大肠相表里的现代机制研究 |
| 3 肺与大肠相表里的临床运用 |
| 参考文献 |
| 综述二 过敏性哮喘的发生机制研究进展 |
| 1 哮喘与发病因素 |
| 2 过敏性哮喘的免疫学发病机制 |
| 3 过敏性哮喘与肠道菌群 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 过敏性哮喘小鼠模型中的肺肠组织形态动态变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 “从肠论治”对过敏性哮喘肺肠炎症及Treg/Th17的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 “从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肠道菌群的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）基于UPLC-Q-TOF/MS技术的生、醋五味子抗肝损伤效应物质基础及代谢组学研究（论文提纲范文）
| 符号&缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 五味子炮制研究进展 |
| 1.1 炮制历史沿革 |
| 1.2 现代炮制研究 |
| 2 五味子化学成分研究进展 |
| 2.1 木脂素类 |
| 2.2 多糖类 |
| 2.3 挥发油类 |
| 2.4 其他成分 |
| 3 五味子药理研究进展 |
| 3.1 对肝脏的作用 |
| 3.2 对心血管系统的作用 |
| 3.3 对免疫系统的影响 |
| 3.4 抗氧化和抗衰老的作用 |
| 4 酒精性肝损伤的研究进展 |
| 4.1 酒精性肝损伤的发病机制 |
| 4.1.1 乙醇及其代谢产物乙醛所致肝损伤 |
| 4.1.2 氧化应激反应与脂质过氧化 |
| 4.1.3 内毒素及炎症因子的浸润 |
| 4.1.4 氧化还原免疫系统的改变 |
| 4.2 五味子干预酒精性肝损伤的研究现状 |
| 5 代谢组学及其在中药中的研究进展 |
| 5.1 代谢组学的基本概念和特点 |
| 5.2 色谱-质谱联用技术在代谢组学中的应用 |
| 5.2.1 气相色谱-质谱联用(GC-MS) |
| 5.2.2 液相色谱-质谱联用(LC-MS) |
| 5.3 代谢组学数据分析与处理研究进展 |
| 5.3.1 数据预处理 |
| 5.3.2 模式识别 |
| 5.3.3 代谢组学数据库 |
| 5.3.4 代谢组学数据处理软件 |
| 5.4 代谢组学在中药研究中的应用 |
| 5.4.1 中药质量控制研究 |
| 5.4.2 中药安全性和毒性评价研究 |
| 5.4.3 中药药物代谢组学研究 |
| 5.5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 五味子醋制前后潜在差异化学标记物研究 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 样品制备 |
| 2.2.1 生、醋五味子炮制品的制备 |
| 2.2.2 生、醋五味子供试品的制备 |
| 2.2.3 混合对照品的制备 |
| 2.3 色谱条件 |
| 2.4 质谱条件 |
| 2.5 五味子化学成分自建数据库 |
| 2.6 多元统计分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 多元统计分析与特征标记物筛选 |
| 3.2 化学标记物的分析鉴定 |
| 4 小结 |
| 第二章 生、醋五味子提取物肝损伤大鼠体内代谢研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂与药材 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 色谱检测条件 |
| 1.4 质谱检测条件 |
| 1.5 样品制备 |
| 1.5.1 生、醋五味子提取物及给药样品制备 |
| 1.5.2 对照品溶液的制备 |
| 1.5.3 生物样品的采集与供试液的制备 |
| 1.5.4 大鼠血浆样品供试液的制备 |
| 1.5.5 大鼠尿液、粪便、胆汁样品供试液的制备 |
| 1.6 数据采集 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 肝脏病理模型分析 |
| 2.2 大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁UPLC-Q-TOF/MS分析 |
| 2.3 PeakView数据处理与分析 |
| 2.3.1 木脂素原型成分的结构鉴定 |
| 2.3.2 木脂素代谢产物的解析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 生、醋五味子抗酒精性肝损伤代谢组学研究 |
| 第一节 五味子抗急性酒精性肝损伤的药理学验证 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验动物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 给药样品溶液的制备 |
| 3.2 大鼠急性酒精性肝损伤模型的制备和药物干预 |
| 3.3 动物的处理 |
| 3.4 大鼠血清的制备 |
| 3.5 10%肝匀浆的制备 |
| 3.6 观察指标及方法 |
| 3.6.1 动物一般情况 |
| 3.6.2 肝脏形态学观察 |
| 3.6.3 肝脏HE染色、诊断标准和结果判定 |
| 3.7 肝功能指标的测定 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 大鼠外在观察 |
| 4.2 肝脏的形态及病理学观察 |
| 4.2.1 肝脏形态学观察 |
| 4.2.2 肝脏病理学变化观察及评分结果 |
| 4.3 各组大鼠肝功能的变化情况 |
| 4.3.1 大鼠血清AST、ALT、AKP、GGT的活力变化 |
| 4.3.2 肝组织ALT、AST、AKP的酶活力变化 |
| 第二节 五味子抗急性酒精性肝损伤代谢组学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 生、醋五味子饮片及提取液的制备 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 大鼠血浆、胆汁的采集 |
| 2.4 样品前处理 |
| 2.5 UPLC-Q-TOF/MS分析 |
| 2.5.1 色谱条件 |
| 2.5.2 Q-TOF/MS质谱条件 |
| 2.5.3 数据分析 |
| 3 实验方法的选择与优化 |
| 3.1 样品的前处理 |
| 3.2 分析条件的选择和优化 |
| 3.3 数据处理方法的选择和优化 |
| 3.3.1 分析系统稳定性评价 |
| 3.3.2 差异化合物分子特征提取 |
| 3.4 差异代谢物的鉴定 |
| 4 结果与讨论 |
| 4.1 五味子抗酒精性肝损伤血浆代谢组学研究 |
| 4.1.1 血浆样品总离子流图(TIC)分析 |
| 4.1.2 模式识别与判别分析 |
| 4.1.3 生、醋五味子血浆代谢物组间差异代谢物的鉴定 |
| 4.1.4 血浆代谢物代谢通路分析 |
| 4.1.4.1 磷脂代谢 |
| 4.1.4.2 鞘脂代谢 |
| 4.2 五味子抗肝损伤胆汁代谢组学研究 |
| 4.2.1 胆汁样品总离子流图(TIC)分析 |
| 4.2.2 模式识别与判别分析 |
| 4.2.3 生、醋五味子胆汁代谢物组间差异代谢物的鉴定 |
| 4.2.4 胆汁代谢物代谢通路分析 |
| 4.3 血浆、胆汁差异代谢物及相关代谢通路综合分析 |
| 4.3.1 胆酸内分泌与脂代谢 |
| 4.3.2 花生四烯酸与甘油磷脂代谢通路 |
| 4.3.3 ROS与CYP450酶 |
| 4.3.4 PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 5 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 总结与讨论 |
| 1.1 五味子相关文献研究 |
| 1.2 五味子醋制前后潜在化学标记物研究 |
| 1.3 生、醋五味子醇提取物肝损伤大鼠体内代谢研究 |
| 1.4 五味子抗酒精性肝损伤代谢组学研究 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）四磨汤口服液治疗肝郁气滞型IBS-C的疗效分析和机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 肠易激综合征IBS的研究现状 |
| 1.胃肠运动与IBS的发病机理 |
| 2.肠易激综合征的诊断标准与分型 |
| 3.中医学对肠易激综合征的辩证诊断及治疗 |
| 4.四磨汤口服液在治疗肠易激综合征IBS的应用与研究 |
| 5.现代医学治疗肠易激综合征IBS |
| 第二节 IBS与肠神经系统 |
| 1.肠神经系统(ENS)的解剖 |
| 2.肠神经系统的自主性 |
| 第三节 IBS与突触可塑性 |
| 1.突触前终末 |
| 2.突触间隙 |
| 3.突触后成份 |
| 第四节 肠易激综合征性疾病与P物质 |
| 1.P物质的分布 |
| 2.P物质的生理作用 |
| 3.P物质与消化系统 |
| 第五节 肠易激综合征性疾病与血管活性肠肽(VIP) |
| 1.血管活性肠肽的分子结构和基因结构 |
| 2.血管活性肠肽的合成和释放 |
| 3.血管活性肠肽的分布 |
| 4.血管活性肠肽的生理作用 |
| 5.血管活性肠肽与消化系统 |
| 第六节 IBS动物模型研究 |
| 1 动物模型的制备方法 |
| 2 动物模型制备研究进展 |
| 第七节 文献综述总结 |
| 第二章 临床试验研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方案 |
| 第二节 临床病例资料研究结果 |
| 1 一般资料两组比较 |
| 2 两组患者治疗前主要症状比较 |
| 3 两组患者治疗前后主要症状比较 |
| 4 两组患者证候疗效疗效比较 |
| 第三节 临床研究讨论 |
| 1 肠运动功能性障碍疾病的病因病机认识 |
| 2 便秘型肠易激综合征的治疗 |
| 3 四磨汤口服液治疗便秘型肠易激综合征的疗效分析 |
| 4 四磨汤口服液治疗便秘型肠易激综合征无效病例分析 |
| 第三章 动物实验研究 |
| 第一节 四磨汤口服液对肝郁气滞证大鼠胃肠运动的影响 |
| 1 验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 四磨汤口服液对肝郁气滞证大鼠结肠突触可塑性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 四磨汤口服液对肝郁气滞证大鼠脑肠肽的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 主要英文缩略词表 |
| 附录：免疫组化法观察结肠肌间神经丛SP (X400) |
| 附录：免疫组化法观察结肠肌间神经丛VIP (X400) |
| 研究生在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）鸡肠道Cajal间质细胞与肠神经系统的特性研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 胃肠道Cajal间质细胞的研究进展 |
| 第一节 ICC的形态和鉴定 |
| 1 光镜水平的鉴定标准 |
| 2 电镜水平的鉴定标准 |
| 第二节 ICC的分布和发育 |
| 1 ICC在消化道中的分布 |
| 2 SCF/c-kit信号途径与ICC的发育 |
| 第三节 ICC的功能 |
| 1 参与胃肠道平滑肌活动的起搏 |
| 2 参与电活动的传播 |
| 3 介导神经信号传递 |
| 第四节 非哺乳动物胃肠道ICC的研究现状 |
| 1 鸟类动物胃肠道ICC的研究 |
| 2 爬行类动物胃肠道ICC的研究 |
| 3 两栖类动物胃肠道ICC的研究 |
| 第五节 与Cajal间质细胞有关的疾病 |
| 1 Hirschsprung病 |
| 2 糖尿病性胃轻瘫 |
| 3 贲门失弛缓症 |
| 4 溃疡性结肠炎 |
| 5 胃肠道肿瘤 |
| 6 慢传输型便秘 |
| 参考文献 |
| 第二章 肠神经系统的研究进展 |
| 第一节 肠神经系统的形态学结构 |
| 第二节 肠神经系统的作用机制 |
| 第三节 肠神经系统的来源与发育 |
| 第四节 肠神经系统的重要神经递质 |
| 1 肠神经系统主要兴奋性神经递质 |
| 2 肠神经系统主要抑制性神经递质 |
| 第五节 ENS与ICC之间的联系 |
| 第六节 鸟类ENS的研究现状 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 鸡肠道Cajal间质细胞的超微结构研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 透射电镜制样与观察 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡肠道c-kit mRNA阳性细胞分布及其表达 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物与样品处理 |
| 1.2 原位杂交试验 |
| 1.3 RT-PCR试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 原位杂交结果 |
| 2.2 RT-PCR结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 不同日龄鸡肠道c-kit及其配体SCF mRNA的表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA抽提结果 |
| 2.2 RT-PCR动力扩增曲线、产物熔解曲线 |
| 2.3 鸡各肠段去粘膜后肠壁组织中c-kit和SCF mRNA检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 鸡肠道Vimentin与NSE免疫荧光双标研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及标本制备 |
| 1.2 vimentin与NSE免疫细胞化学双重荧光染色 |
| 2 结果 |
| 2.1 肌间层和粘膜下层区域 |
| 2.2 环肌层和纵肌层内 |
| 2.3 粘膜内 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 鸡肠道肌间层NOS阳性神经元胚后发育的结构研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 鸡回肠粘膜下层AChE阳性神经元的胚后发育研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡肠粘膜下神经丛AChE阳性神经节密度的日龄变化 |
| 2.2 鸡肠粘膜下层AChE阳性神经节中AChE阳性神经元数目的日龄变化 |
| 2.3 鸡肠粘膜下层AChE阳性神经元面积的日龄变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 鸡回肠段胆碱能和氮能神经元的组织化学定位 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物和组织标本制备 |
| 1.2 乙酰胆碱酯酶组织化学染色 |
| 1.3 NADPH-d组织化学染色 |
| 1.4 阳性神经元数量和密度测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 冰冻切片观察 |
| 2.2 铺片观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）人胚胎脊髓发育过程中NTs家族及其受体的表达及变化（论文提纲范文）
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| IHC 彩图版 |
| ISH 彩图版 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 引言部分参考文献 |
| 方法及讨论部分参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、神经激肽A在大鼠结肠发育中的定性定量分析（论文参考文献）
- [1]肛门直肠畸形大鼠盆底肌发育异常的分子机制及其宫内移植干细胞修复作用的研究[D]. 姚致雅. 中国医科大学, 2020(01)
- [2]维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究[D]. 曹菲. 电子科技大学, 2019(04)
- [3]硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究[D]. 孔竞谊. 成都中医药大学, 2019(04)
- [4]瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究[D]. 徐岩. 中国人民解放军海军军医大学, 2018(01)
- [5]“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠Th17/Treg及肠道菌群的影响[D]. 吴佳佳. 北京中医药大学, 2017(05)
- [6]基于UPLC-Q-TOF/MS技术的生、醋五味子抗肝损伤效应物质基础及代谢组学研究[D]. 苏联麟. 南京中医药大学, 2017(01)
- [7]四磨汤口服液治疗肝郁气滞型IBS-C的疗效分析和机理研究[D]. 韩棉梅. 广州中医药大学, 2012(09)
- [8]鸡肠道Cajal间质细胞与肠神经系统的特性研究[D]. 杨平. 南京农业大学, 2012(12)
- [9]人胚胎脊髓发育过程中NTs家族及其受体的表达及变化[D]. 李力燕. 昆明医学院, 2007(05)
- [10]神经激肽A在大鼠胃发育中的定性定量分析[J]. 郭建辉,王廷华,李力燕. 神经解剖学杂志, 2005(02)