一、梯度离心法在肿瘤药敏试验中的应用及临床相关性研究（论文文献综述）
杨生海[1]（2021）在《口蹄疫灭活抗原稳定性及灭活疫苗效力检验替代方法的研究》文中进行了进一步梳理【目的】旨在对口蹄疫抗原的稳定特性及去除检测过程中的杂质干扰进行研究,比较分析四种口蹄疫146S抗原含量的检测方法,筛选出易于标准化的146S抗原含量检测方法。检测免疫后猪血清中细胞因子的动态变化。与免疫动物的血清抗体检测法及豚鼠免疫攻毒保护试验作比较,筛选出适合本动物效力检验的替代方法。【方法】分别用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦Cary 100紫外分光光度计定量法、蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法、高效液相体积排阻色谱法及ELISA检测法四种检测方法,对口蹄疫灭活抗原中的146S含量进行检测,对四种检测方法的数据进行统计分析。将4种不同毒株的口蹄疫灭活抗原在50℃条件下裂解一定的时间,将口蹄疫A型抗原和O型抗原各一株分别4℃放置12个月以及反复多次冷冻处理,口蹄疫抗原用全能核酸酶处理,然后用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法检测处理前后的146S抗原含量变化。利用高效液相体积排阻色谱法检测三批猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗试验苗中的有效抗原146S含量,并用口蹄疫各型抗原ELISA检测试剂盒分别检测疫苗中O型和A型的抗原含量,用ELISA方法检测免疫后猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10的动态变化,利用液相阻断ELISA的方法检测动物免疫28天后的抗体水平,分别用豚鼠免疫攻毒保护试验和本动物免疫攻毒保护试验的方法检测疫苗的效力(PD50),分析抗原含量和PD50之间、豚鼠免疫攻毒保护试验和本动物免疫攻毒保护试验之间、动物免疫后的抗体水平和PD50之间的因果关系。【结果】四种检测方法的检测数值相关性极显着,呈正相关性。口蹄疫抗原1号株（Asia I型）和口蹄疫抗原2号株（A型）稳定性最强,口蹄疫抗原4号株（O型）稳定性最差。4℃放置12个月后的抗原含量没有变化,而反复多次冷冻处理后的抗原含量降解较多。全能核酸酶处理后的抗原含杂蛋白少。三批猪口蹄疫O型、A型灭活疫苗试验苗每头份疫苗中的146S抗原含量分别为1.08μg、7.48μg、15.63μg。试验猪免疫攻毒保护试验,对FMD/O/MYA98/BY/2010CF3检验用强毒的半数保护剂量(PD50)分别为7.49、11.84、15.59。对FMD/A/GDMM/2013CF2检验用强毒的半数保护剂量分别为7.49、10.81、15.59。豚鼠免疫攻毒保护试验,对FMD/O/MYA98/BY/2010CF3检验用强毒的半数保护剂量(PD50)分别为9.00、9.00、11.84。对FMD/A/GDMM/2013CF2检验用强毒的半数保护剂量分别为7.19、11.84、10.32。相对于对照组实验猪,免疫猪血清中的IFN-γ水平显着上升,IL-10水平下降,IL-4水平显着上升。t检验显示,试验动物的抗体效价对数与本动物攻毒保护率（概率单位）存在正相关性（p<0.01）,一元线性回归方程为y=2.436x+1.840,相关系数R2=0.462,相关性较显着。豚鼠攻毒保护率与本动物攻毒保护率存在正相关性（p<0.01）,一元线性回归方程为y=1.3491x-1.841,相关系数R2=0.4581,相关性较显着。三批试验疫苗中146S含量与攻毒保护率(PD50)存在正相关性（p<0.01）,且相关性极显着,一元线性回归方程为y=0.907x+7.186,相关系数R2=0.987。【结论】蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法简便易行,重复性较好,高效液相体积排阻色谱法自动化程度高,快速,重复性好,易于标准化。在50℃条件下,口蹄疫O型抗原稳定性最差,最易发生裂解。口蹄疫抗原或疫苗适合于4℃保存,全能核酸酶能有效去除杂蛋白干扰,提高色谱纯化效率。口蹄疫疫苗免疫后猪血清中细胞因子的动态变化显着,三批试验疫苗中146S含量与本动物攻毒保护率正相关性远大于豚鼠攻毒保护率和抗体效价二者与攻毒保护率的相关性,当每头份疫苗中146S含量大于1μg时,攻毒保护率能达到6个PD50以上,可以考虑将口蹄疫疫苗146S含量检测法作为本动物攻毒实验的效力检验方法的替代方法进行进一步的研究,而血清抗体检测法是田间口蹄疫群体免疫效果评价的理想方法。
孙琳[2]（2021）在《1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究》文中研究说明研究目的:1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种由遗传因素和环境因素共同诱导,细胞免疫及体液免疫共同介导胰岛β细胞损伤的自身免疫性疾病,在儿童和青少年中更为常见。近年来,流行病学研究表明,我国T1DM发病率明显增加,而患者进行性的胰岛功能下降导致其需要终身应用胰岛素治疗,鉴于其逐年增长的发病率和随之出现的多系统并发症,T1DM已成为重大的公共卫生挑战。目前,T1DM的发病机制尚未完全明确,T细胞相关的研究一直是1型糖尿病的研究热点,而近年来除了CD4+T细胞,越来越多的研究表明CD8+T细胞在1型糖尿病的发病进程中有着重要作用。淋巴细胞活化信号分子家族（signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF）被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并显着影响包括CD8+T细胞在内的免疫细胞分化及功能。然而对T1DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T1DM中SLAMF分子如何通过影响CD8+T细胞功能仍不明确。为探讨这一问题,本课题通过对T1DM患者及非肥胖的糖尿病小鼠模型（non-obese diabetic,NOD）免疫细胞分化情况及SLAMF分子表达情况进行分析,并进行mRNA测序及相关的体外细胞实验,以期探讨T1DM免疫系统异常分化及SLAMF分子表达对T1DM免疫微环境下CD8+T细胞功能和命运的影响。研究方法:（1）对T1DM患者及健康对照组（health control,HC）的一般临床资料进行统计,利用流式细胞分析法对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群、B细胞等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞、B细胞和NK细胞表面SLAM分子家族的表达情况;（2）利用流式细胞分析法对T1DM患者外周血中T细胞SLAMF4分子表达及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌情况进行检测,分析SLAMF4分子与细胞活化状态和细胞因子分泌能力之间的相关性;分析SLAMF4分子表达与1型糖尿病一般临床资料的相关性;（3）对自发性1型糖尿病小鼠模型NOD小鼠进行体重、随机血糖监测及小鼠尾静脉采血,对小鼠胰腺组织留取病理,进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosi,HE）染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况;用流式细胞分析法检测小鼠外周血免疫细胞分化及外周血、胰腺引流淋巴结CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（4）采用流式细胞分选技术得到纯化的T1DM患者的SLAMF4+CD8+T细胞和SLAMF4-CD8+T细胞,并进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;（5）应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD8+T细胞,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体刺激下进行培养,检测作用不同时间CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（6）采用磁珠分选联合流式细胞分选技术正常健康人SLAMF4阳性CD8 T细胞和SLAMF4阴性CD 8 T细胞分别进行分选,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,用CFSE标记细胞,检测细胞增殖情况,并于Day6检测两种细胞的凋亡情况。研究结果:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4+T细胞和B细胞比例增多,Treg细胞的比例降低,总NK细胞及其CD56dim亚群的NK细胞比例减低,CD56bright亚群的NK细胞比例升高。与HCs相比,T1DM患者外周血PBMC中SLAMF4阳性的总T细胞百分比降低,且SLAMF4阳性的CD8+T细胞明显降低;SLAMF3分子表达在B淋巴细胞比例有所降低,SLAMF5在NK细胞表面表达升高,差异均有统计学意义。（2）T1DM患者T细胞表面SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关,且与SLAMF4阴性CD8+T细胞相比,SLAMF4阳性CD8+T细胞具备更强的分泌促炎因子IFN-γ和TNF-a的能力;在与T1DM相关的一般临床指标的分析中,发现SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比与糖化血红蛋白水平及T1DM病程呈负相关。（3）与同周龄的Balb/c小鼠相比,NOD小鼠CD4+T细胞及CD4+CD25+的调节性T细胞百分比明显降低,随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下降,且明显低于对照Balb/c小鼠。（4）mRNA转录组测序结果表明,1型糖尿病中SLAMF4作用后的CD8+T细胞表现出多个信号通路的异常改变,包括T细胞受体信号相关的信号通路、细胞因子分泌及细胞凋亡通路,差异表达的基因中也有多个与凋亡相关的基因,说明SLAFM4在1型糖尿病中调控CD8+T细胞的活性与命运。（5）通过体外培养人脐带血CD8+T淋巴细胞发现,一定程度的抗原刺激可促进SLAMF4在脐带血na?ve CD8+T细胞表面上调表达,随着免疫活化的时间延长,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下调。（6）通过SLAMF4阳性CD8+T细胞和SLAMF4阴性CD8+T细胞经CFSE标记后体外培养,发现SLAMF4阴性CD8+T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增,增殖能力强,而SLAMF4阳性CD8+T细胞更容易凋亡。研究结论:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,且外周血T细胞及B细胞表面多种SLAM分子表达水平发生变化,结合课题组前期结果,这在T1DM及T2DM之间存在一定共性和不同之处。（2）与HCs相比,T1DM患者SLAMF4阳性CD8 T细胞百分比显着下降,且SLAMF4分子表达与细胞活化的状态及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌有关。在T1DM患者中,SLAMF4+CD8+T细胞百分比与患者的糖化血红蛋白水平和1型糖尿病病程呈负相关。（3）在动物模型中我们发现NOD小鼠也存在外周血T细胞异常分化状态。且随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T百分比逐渐下降,明显低于对照Balb/c小鼠。（4）SLAMF4分子表达与1型糖尿病患者CD8+T细胞功能调控及凋亡显着相关,SLAMF4阳性的CD8+T细胞增殖能力较差且更容易凋亡,故体内持续抗原刺激会导致表达SLAMF4的CD8+T细胞的百分比降低,使其发挥类似调定点作用。综上所述,本课题首次分析了T1DM疾病模型中的SLAMF分子家族的表达谱,为SLAMF分子与T1DM免疫细胞的调控提供了实验证据,证实了在1型糖尿病免疫微环境中SLAMF4表达对CD8+T细胞的功能影响和命运的调控及SLAMF4阳性CD8+T细胞比例变化的具体机制,提示SLAMF4分子可能为T1DM的早期诊断,临床分期或免疫干预提供新靶点。
耿慧君[3]（2020）在《金葡菌噬菌体的筛选及对小鼠乳腺炎的抑制作用与机理研究》文中提出奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中危害最大、最常见的疾病。金黄色葡萄球菌（金葡菌）是其最重要的一种致病菌,据报道,超过25%的临床型奶牛乳腺炎由金葡菌引起。而抗生素的大量使用,会导致细菌耐药性和超级细菌的产生,对生态环境的平衡也会造成极大危害。噬菌体是一种结构简单、广泛存在、高效安全的生物抗菌剂,具有高特异性、高裂解子代数及高环境丰度等优点。迄今为止,关于噬菌体治疗金葡菌性乳腺炎的研究较多,但对于其实际应用的生物安全性机制,以及对肠道微生态的副作用等尚未见报道。本研究将噬菌体全基因组测序与小鼠转录组分析相结合,评估了噬菌体作用于金葡菌性乳腺炎的安全性;将肠道菌群微生态与炎性因子分析相结合,探讨了噬菌体有效抑制金葡菌性乳腺炎的作用机制。旨在为噬菌体疗法在该领域的应用提供理论基础与实践依据。具体研究内容和结果如下:（1）筛选得到一株高致病性、多重耐药的金葡菌,以其为宿主菌分离获得两株裂解性能良好、广谱性的噬菌体,并检测了相关理化性质与生物学特性。从55份患有临床型乳腺炎的病牛奶样中分离得到34株病原菌,其中金葡菌6株（17.65%）。因金葡菌Sau-XJ-21呈现最多的抗生素耐药性与较高的致病性（半数致死量LD50为1.26×106 CFU/mL）,则以其为宿主菌,筛选获得两株裂解性噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2。利用双层平板法、CsCl密度梯度离心法、透射电子显微镜（TEM）、点板法（spot-test）、一步生长曲线构建、pH值及温度稳定性检测和体外抑菌实验等,检测了噬菌体的形态特征、宿主谱、理化性质及对病原菌的体外抑制作用,结果表明,两株噬菌体均隶属于有尾目噬菌体,亥瑞勒噬菌体科;具有广谱性,能够裂解不同来源（牛源、人源）不同区域（新疆、浙江和大连）的金葡菌;单一噬菌体及噬菌体cocktail（体积1:1）均能有效抑制金葡菌Sau-XJ-21生长。（2）对两株噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2进行全基因组测序与注释,阐明二者均不含毒力基因、溶源基因及毒力转座子等,不存在基因水平转移风险,具有应用安全性。利用Illumina Genome Analyzer测序技术对两株噬菌体进行全基因组测序;选择GeneMarkS、CGView、tRNAscan-SE、Cluster X 和 MEGA 7.0 等生物信息学软件和程序,对两株噬菌体进行全基因组分析、功能基因注释、tRNA形态结构预测与分类学地位分析;运用 ExPASy、TCDB、PortScale、Signal 5.0、Phyre2和Swiss-Model等生物信息学程序,对噬菌体裂解酶Lys-vBSM-A1进行一级结构分析、理化性质鉴定、功能区域预测（疏水性、跨膜区域和信号肽）、二级结构预测与结构域3-D模型构建,结果显示噬菌体vBSM-A1和噬菌体vBSP-A2均为双链线性DNA,vBSM-A1/vBSP-A2基因组全长140,654/136,528 bp,GC含量为30.33%/30.45%,预测出70/77个具有实际功能的基因和4/3个tRNA编码基因;两株噬菌体Genebank ID分别为MK584893和MK656892;二者均含有同一个序列保守的裂解酶基因Lys-vBSM-A1,其大小为267aa,其表达蛋白含两个典型的活性域,位于N端的c4olkB结构域和位于C端的c4olsA结构域。（3）评估了噬菌体混合制剂对金葡菌性小鼠乳腺炎的治疗作用;阐明了其对小鼠肠道微生态的调节与改善;考察了噬菌体经小鼠乳腺灌注的安全性影响,分析了小鼠转录组表达变化与潜在作用机制。利用金葡菌Sau-XJ-21成功构建了小鼠乳腺炎模型,评估并确定3×104 CFU/25 μL为最佳攻菌浓度。探究了噬菌体cocktail对金葡菌性小鼠乳腺炎的治疗,使用Beckman Coulter DxH8000血液分析仪、点板法（spot-test）、ELISA酶联免疫吸附测定、H&E组织切片染色等仪器与方法,检测了各实验组小鼠的血液样本参数、CFU和PFU负荷、炎症因子TNF-α和IL-1β指标与小鼠乳腺组织病理学形态,结果显示噬菌体cocktail在小鼠乳腺内能有效减轻金葡菌Sau-XJ-21造成的炎症症状;小鼠肠道菌群分析结果显示,头孢噻呋钠会破坏小鼠肠道内原有的优势菌株,降低菌群丰度;而噬菌体混合制剂治疗组,能够有效改善乳腺炎导致的肠道菌群紊乱,调节肠道微生态平衡。运用Illumina HiSeq测序技术进行小鼠转录组测序,对差异表达基因GO分类与KEGG富集分析,发现相较于PBS对照组,噬菌体灌注组在一些与炎症相关的基因（如细胞凋亡、细胞聚集及抗氧化活性等）表达中,存在较明显的差异表达;同时在与炎症因子相关的一些通路（如TNF信号通路以及NF-κB信号通路等）中显示出显着富集,提示了噬菌体在小鼠体内会引发一些相关的免疫反应和炎症应答。综合小鼠形态学观察、乳腺组织病理学切片分析、炎症因子TNF-α检测,以及噬菌体负荷检测等结果,揭示了噬菌体灌注形成的炎症特征轻微,对小鼠正常生命体征无碍。综上,本论文以致病性金葡菌为目标菌株,分离获得两株裂解性噬菌体;研究了施用噬菌体混合制剂治疗小鼠金葡菌性乳腺炎的有效性;揭示了该噬菌体混合制剂在调节小鼠肠道菌群丰度、改善肠道微生态平衡中,相较于抗生素的优越性;从全基因组、转录组、炎症因子、小鼠表观状态及乳腺噬菌体负荷等角度,初步阐明了噬菌体混合制剂的应用安全性。因此,该噬菌体混合制剂是一种能够在体外和体内均有效抑制金葡菌生长的生物安全制剂,具有较高的应用前景和可行性。
石晓娟[4]（2020）在《糖基转移酶Fut8影响CD8+T细胞功能的机制研究》文中研究说明研究背景和目的恶性肿瘤是人类健康的重大威胁之一。免疫治疗经过一个多世纪的发展,已经成为继手术、化疗和放疗之后的重要肿瘤治疗手段。免疫治疗是通过激活“肿瘤-免疫”循环,恢复机体的抗肿瘤免疫反应。CD8+T细胞作为人体适应性免疫系统的重要成员,发挥主要的抗肿瘤作用。近年来,研究发现肿瘤细胞能够激活CD8+T细胞中的免疫抑制受体来抑制后者的杀伤活性,从而逃避免疫监视和免疫清除。针对这一问题,靶向T细胞免疫抑制分子并解除免疫抑制的抗体或小分子抑制剂被大量研发。虽然这些免疫抑制阻断剂能够有效活化CD8+T细胞并在临床中取得一定效果,但是仍有大量患者无法从此类治疗中获益。因此,尚需对CD8+T细胞中免疫抑制受体的表达调控进行深入研究,为提升肿瘤免疫治疗效果提供方向。目前,已发现了数十种T细胞免疫抑制受体。其中,对于程序性细胞死亡蛋白1（programmeddeath-1,PD-1）,T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（Tcell immunoglobulinandmucindomain-3,TIM-3）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4,CTLA-4）等的研究较多。针对单个靶点的阻断或多靶点联合阻断,能够一定程度上解除T细胞免疫抑制。但是不同免疫抑制受体间存在补偿效应,即阻断一个或数个受体不能完全解除T细胞免疫抑制。针对这一困境,我们希望探讨在不同免疫抑制受体表达中都存在的调控机制,为未来免疫抑制广谱阻断药物的开发提供方向。作为蛋白质转录后修饰的一种方式,糖基化修饰在蛋白质中广泛存在,对膜蛋白质的正确定位、构象稳定、蛋白质稳定性以及活性尤为重要。因此,探讨蛋白质糖基化修饰对T细胞功能和免疫抑制受体表达的影响将有助于免疫治疗药物发现。但是,对于CD8+T细胞中蛋白质糖基化修饰的情况尚不清楚。因此,本课题主要分析了 CD8+T细胞活化过程中糖基化修饰酶的表达改变以及这种改变对T细胞功能和关键免疫抑制受体PD-1表达的影响。针对全基因组范围基因表达改变,采用高通量测序技术,尤其是染色质可及性（ATAC）测序进行研究具有较大优势。染色质可及性测序是通过转座酶结合在开放染色质的区段,通过对处理后的染色质片段进行建库测序,可以对样本染色质状态进行研究,实现全基因组范围内检测染色质的开放状态,其在研究糖基化修饰中具有重要的结构指示作用。同时第二代（RNA）测序技术因通量高,技术成熟,能够快速准确全面的检测基因的表达量,对于了解整个转录组基因表达的情况具有极大的优势,其在研究糖基化修饰相关基因具有的重要指导作用。这两者结合分析在研究糖基化修饰对CD8+T细胞功能的影响提供有力的技术支持。为了研究糖基化修饰酶对CD8+T细胞功能和免疫抑制受体的影响,本论文主要分为三部分:第一部分通过构建体外活化CD8+T细胞模拟体内肿瘤细胞通过TCR信号通路活化免疫细胞的模型,采用ATAC测序及RNA测序技术,对该活化过程中糖基化修饰酶编码基因染色质及转录组进行全面分析,寻找在细胞活化中糖基化通路的关键蛋白;第二部分通过对原代CD8+T细胞及Jurkat模式细胞进行机制研究,采用生物学信息学的方法及基因编辑的手段,筛选出在活化模型中对糖基化通路具有重要调控意义的分子,并验证其对免疫抑制分子PD-1糖基化的调控作用,最终探究对T细胞功能的影响;第三部分通过采用异种移植瘤动物模型、临床肿瘤患者样品及GEO数据库,进行分析及验证所筛选的分子对CD8+T细胞的糖基化修饰进行的调控及机制,为未来提高免疫治疗效果提供新思路。第一部分 CD8+T细胞活化过程中糖基化修饰酶编码基因的染色质可及性和转录全景式分析:为了观察糖基化修饰酶在T细胞活化不同阶段的改变,我们利用抗CD3和抗CD28抗体对健康人来源的幼稚CD8+T细胞分别刺激0天,3天和7天。取活化不同时间的T细胞进行ATAC测序,确认送检样品和测序数据质量符合后续研究要求后,对相关数据进行了生物信息学分析,分析方法主要包括主成分分析、开放区段在基因功能元件上的分布及聚类分析、开放区段相关差异基因的功能富集分析、开放区段相关基因的聚类分析,以及蛋白质转录后修饰相关通路活化分析,并对相关结果进行了可视化展现。结果显示,测序质量良好、样品聚类显着,满足了后续分析要求;在T细胞活化过程中,染色质结构出现了大范围打开状态,特别是转录起始位点附件存在大量开放片段,提示T细胞活化过程中发生了剧烈的基因转录调控;功能富集分析发现细胞活化通路相关基因被显着富集,进一步证明T细胞被充分活化;对活化不同时间的测序数据进行相关基因聚类分析发现细胞活化指示分子具有较好时间依赖性富集;联合T细胞体内活化测序数据（公共数据）分析发现,本研究构建的T细胞活化模型与体内活化模型的基因改变高度一致,提示本研究结果具有广泛生物学意义。除了糖基化修饰,蛋白质还会发生泛素化、磷酸化、甲基化等修饰。通过对这些转录后修饰相关酶编码基因的转录活性进行分析和对比,我们发现糖基化修饰基因的转录活性变化最为明显。通过对15条糖基化修饰通路进行比对分析,结果显示N连接的糖基化修饰的染色质状态具有明显的可及性调控。因此,我们接下来重点研究了 N连接糖基化修饰。为了了解在活化不同阶段糖基化修饰酶全基因转录组的改变,我们对同一批样品进行了 RNA测序分析,在确认数据质量符合后续分析要求后,进行了生物信息学分析,分析方法包括组间差异基因集合分析及聚类分析,并对相关结果进行了可视化展现。结果显示组间差异的559个基因有7个糖基化修饰酶,而位于N连接糖基化修饰通路中的岩藻糖基转移酶8（Fut8）是最具有明显差异的基因。总之,第一部分结果表明我们构建的体外T细胞活化模型能再现体内相关过程,并发现在活化过程中N连接糖基化修饰具有重要意义,且Fut8为最具有代表性的糖基化修饰酶,为后续探究糖基化对T细胞活化的机制研究提供了基础。第二部分 糖基化修饰酶Fut8对CD8+ T细胞功能以及PD-1表达的影响研究:为了验证Fut8在T细胞活化不同阶段的改变及对T细胞功能的影响,我们按照建立的活化体系对T细胞进行激活,然后分别用荧光定量PCR,免疫印迹（western blot）,细胞免疫荧光,流式细胞术和酶联免疫吸附测定法（ELISA）等方法在不同时间点对细胞活化水平及Fut8表达进行检测,结果提示在随着T细胞活化,Fut8表达逐渐升高;其次,我们用小干扰RNA（siRNA）,采用细胞电穿孔的试验方法,敲低原代CD8+T细胞及Jurkat细胞中Fut8的表达,建立敲低细胞模型,分别用荧光定量PCR,免疫印迹,细胞免疫荧光等方法,对敲低效率进行检测,结果显示设计的小干扰RNA在基因和蛋白水平均显着降低Fut8表达;最后,我们采用ELISA和流式细胞术检测对Fut8敲低表达的CD8+T细胞进行功能检测,结果显示Fut8表达降低显着抑制T细胞杀伤和增殖功能。至此,我们确认CD8+T细胞活化促进Fut8表达,而Fut8对T细胞正常增殖和发挥杀伤功能不可或缺。接下来,我们探究了调控Fut8表达的转录因子。首先,我们结合已有的测序数据以及生物信息学进行预测,选择了 NFATc1,NFATc2,NF-kB,JUN等4个转录因子;然后对这四种转录因子分别采用了抑制剂处理,siRNA抑制,以及ATAC测序结果比对等手段分别进行验证,最终发现NFATc2是Fut8调控的关键转录因子。为了解NFATc2在细胞活化过程中的表达及对T细胞功能的影响,我们采用了荧光定量PCR,免疫印迹和细胞免疫荧光等对NFATc2进行了检测,结果显示随着T细胞活化,NFATc2表达升高;利用siRNA敲低原代CD8+T细胞及Jurkat细胞中NFATc2表达后,分别用荧光定量PCR和免疫印迹对敲低效率进行检测,结果显示NFATc2在基因和蛋白水平均显着降低。同时,在NFATc2敲低表达的细胞中,Fut8蛋白表达也下调;采用ELISA和流式细胞术对敲低NFATc2的CD8+T细胞进行功能检测,结果显示NFATc2敲低细胞的杀伤和增殖功能受到明显抑制。为了证明两者的直接调控关系,我们采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）检测了 NFATc2与Fut8基因的结合,结果显示NFATc2能够结合Fut8编码基因的调控区,直接促进Fut8表达。至此,我们发现CD8+T细胞活化过程中,转录因子NFATc2表达上调并促进Fut8转录增强,进而促进T细胞增殖和杀伤活性。最后,我们探讨了 Fut8对PD-1表达的影响。我们首先采用流式细胞术、细胞免疫印迹及PCR等分析了 6种免疫抑制和活化受体,结果显示PD-1在基因和蛋白质水平存在表达不一致的情况;随后,我们对敲低Fut8表达的原代CD8+T细胞进行了 PD-1检测,结果显示敲低Fut8表达的T细胞中PD-1表达显着降低。Fut8介导的糖基化修饰对PD-1表达起到至关重要的作用。对PD-1蛋白质中存在4个潜在糖基化修饰位点进行突变后,发现第49位氨基酸（N49）和第74位氨基酸（N74）发挥主要的调控功能。为了探究在CD8+T细胞的活化过程中,岩藻糖基化修饰对PD-1的影响,我们首先用CD8+T细胞作为工具细胞,设计了针对这两个位点的单独和同时突变的基因序列,采用细胞电穿孔的试验方法进行转染,从而改变糖基化修饰位点的氨基酸,然后用免疫印迹和流式细胞术进行检测PD-1的表达;并采用糖解酶（PNGase F）处理CD8+T细胞表面的PD-1蛋白,检测其糖基化修饰的情况;还将不同位点修饰的CD8+T细胞与PD-L1共孵育,采用ELISA和荧光细胞膜标记流式细胞术等方法,检测细胞因子的分泌和细胞增殖功能。结果显示,N49和N74位点突变能够明显影响PD-1的蛋白分子量,并能降低PD-1表达,同时改变两个位点的影响最为明显;经PNGase F处理后PD-1的蛋白分子量发生了明显降低,证明了 PD-1具有糖基化修饰;在与PD-L1共孵育后,PD-1点突变的CD8+T细胞表现出更好的杀伤及增殖功能。总之,第二部分阐明了 CD8+T细胞在活化过程中转录因子NFATc2通过调控糖基化通路影响细胞功能以及PD-1表达。因此在开展了体外研究之后,我们在小鼠模型以及临床样本中对上述结果进行了验证。第三部分 利用动物模型及临床样本验证Fut8对CD8+T细胞的影响:在明确了 NFATc2-Fut8通路对T细胞的调控后,我们首先利用嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞和异种移植瘤动物模型进行了体内验证。我们向免疫缺陷鼠（SCID-Beige）进行了间皮素阳性肿瘤细胞皮下接种。接种后第五天,予以尾静脉注射靶向间皮素的CD8+CAR-T细胞。注射CAR-T细胞三天后,处死小鼠,分离瘤体和脾脏。对剥离的瘤体和脾脏进行处理后得到单细胞悬液,并进行磁分选得到CD8+T细胞。然后,采用免疫印迹,细胞免疫荧光和流式细胞术等方法对NFATc2,Fut8和PD-1进行检测,并对代表细胞活化及功能的CD69和IFN-γ进行检测,结果显示与脾脏来源的细胞相比,肿瘤来源的T细胞活化程度较高,且NFATc2,Fut8和PD-1表达较强。由此我们可以得出结论,NFATc2-Fut8通路在T细胞活化中非常重要。为了验证相关基因在人体中的变化,我们对新鲜分离的肺癌患者外周血和肿瘤浸润CD8+T细胞进行了检测,结果显示NFATc2,Fut8和PD-1在肿瘤浸润T细胞中较外周血表达高,且肿瘤浸润CD8+T细胞具有广泛糖基化修饰,与前期结果一致。我们还从GEO数据库中筛选了未经治疗的肺癌患者癌及癌旁分离的CD8+T细胞的测序数据,比对了 PD-1,Fut8和NFATc2的表达,结果显示癌与癌旁PD-1表达无差异,但Fut8和NFATc2的表达癌高于癌旁,与前期研究结果一致。因此,本论文从体内外以及临床样本验证了 NFATc2-Fut8通路介导的岩藻糖基化修饰在T细胞活化以及PD-1表达中发挥了重要作用。该条通路的阐明对于未来针对蛋白质糖基化修饰的临床免疫治疗提供了新思路,有助于推动相关治疗进步。
平玉[5]（2020）在《PD-1调控肿瘤微环境CD8+T细胞磷脂代谢重编程及功能的研究》文中进行了进一步梳理背景恶性肿瘤已经成为人类健康的重大威胁。流行病学研究显示,近年来我国恶性肿瘤发病率和致死率在不断升高。在临床上,肿瘤的治疗主要以手术、化疗、放疗或这些手段联合为主。但是,肿瘤患者、特别是晚期患者的预后没有显着改善,因此更加有效的肿瘤治疗手段亟待发展。经过一个多世纪的发展,免疫治疗展示出强大的抗肿瘤潜力并且已经在临床肿瘤治疗中显示了良好效果。例如,嵌合抗原受体T（chimeric antigenreceptorT,CAR-T）细胞治疗和免疫检查点阻断抗体（immune checkpoint blockade,ICB）分别在部分类型血液和实体肿瘤患者治疗取得成功,极大提高了患者5年生存率。但是,这些以T细胞为基础的免疫治疗技术仅在少数患者中有效,特别是在实体肿瘤患者中有效率更低。有研究显示,实体瘤微环境与T细胞之间的相互作用是影响免疫治疗疗效的关键因素。实体瘤微环境中存在众多免疫抑制分子,例如PDL1、CTLA-4、IDO等,其中PDL1被认为是抑制T细胞活性的关键分子。PDL1能够活化T细胞上PD-1进而抑制T细胞的肿瘤杀伤活性。理论上,靶向PDL1或PD-1的阻断抗体治疗能够有效改善肿瘤治疗。实际上,仅有少量患者从阻断治疗中获益,除了 PDL1外,靶向CTLA-4、IDO或其他T细胞抑制因素的治疗也均不能在多数患者中取得有效反应。临床前研究显示,环境因素能够导致T细胞自身代谢改变,进而影响T细胞响应阻断治疗的反应性和肿瘤治疗效果。因此,改善T细胞免疫治疗的前提是深入了解免疫抑制因素与T细胞代谢之间的相关作用以及其对阻断治疗的影响,从而发现关键代谢分子以研发更加有效的联合治疗策略。基于上述思考,本课题主要研究肿瘤微环境中T细胞脂类代谢的改变、脂类代谢对T细胞功能的影响,以及PDL1/PD-1通路与T细胞脂类代谢之间的联系,利用细胞模型、动物模型和临床标本等深入分析了 T细胞代谢对其功能的影响以及作用机制。第一部分 实体瘤肿瘤微环境中CD8+T细胞磷脂代谢降低目的探讨实体肿瘤微环境中CD8+T细胞脂类分子代谢变化,以及脂类代谢与T细胞功能之间的相关性。方法（1）通过流式细胞术,对比肺癌患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞表达共抑制分子（PD-1、CTLA4和Tim3）、功能分子（GranzymeB和IFN-y）以及增殖相关分子Ki67的差异;（2）通过超高效液相色谱技术检测肺癌患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞中脂类分子类型和丰度;通过RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫荧光技术检测肿瘤患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞磷脂代谢相关酶PLPP1的表达;（3）基于公共数据库中36例非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）患者的肿瘤浸润CD8+T细胞测序数据,分析PLPP1表达与信号通路以及T细胞功能分子的相关性;（4）通过在线工具（tumor immune dysfunction and exclusion）,分析 CD8+T细胞浸润和PLPP1表达对肿瘤患者预后的影响。结果（1）通过对肺癌患者外周血和肿瘤组织中活化CD8+T细胞的分析,发现PD-1、CTLA4和Tim3在肿瘤组织中的表达水平较高,而GranzymeB、IFN-γ和Ki67表达水平较低,提示CD8+T细胞在肿瘤微环境中受到抑制;（2）通过超高效液相色谱技术分析发现,不同组织来源的活化CD8+T细胞中脂类分子丰度不同。在肿瘤组织中,CD8+T细胞有较高丰度的磷脂酸（phosphatidicacid,PA）和较低丰度的甘油二酯（diacylglycerol,DG）,磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）,提示CD8+T细胞中磷脂分子的合成能力减弱;（3）通过代谢通路分析发现PLPP1是T细胞磷脂代谢改变的关键酶。进一步分析发现,PLPP1在肿瘤浸润CD8+T细胞中的表达显着低于外周血。因此,我们接下来的研究重点分析PLPP1对T细胞的影响;（4）根据PLPP1表达水平对NSCLC患者CD8+T细胞测序数据进行分组后,发现PLPP1高表达患者中肿瘤浸润T细胞DNA复制、细胞分裂、氧化磷酸化、脂肪酸代谢以及IFN-γ反应相关信号通路较为活跃,提示PLPP1可能参与并调控细胞的增殖,代谢及功能;（5）测序数据还提示PLPP1表达与组织常驻记忆（residentmemoryTcell,Trm）细胞数量、T细胞活化水平及功能正相关;（6）对直肠癌和食管癌患者外周血和肿瘤组织中的活化CD8+T细胞分析,发现PLPP1表达在肿瘤组织中明显低于外周血,进一步提示PLPP1可能在多种实体肿瘤中的表达均降低;（7）对多种实体肿瘤患者CD8+T细胞分析,发现PLPP1表达水平与肿瘤浸润CD8+T细胞数量正相关,提示PLPP1高表达可能能够增加肿瘤微环境中T细胞的浸润及肿瘤杀伤能力。结论实体肿瘤患者中,肿瘤浸润CD8+T细胞的脂类代谢水平受到抑制,其中磷脂代谢相关酶PLPP1与T细胞在肿瘤部位的浸润水平和活化程度紧密相关。PLPP1表达下调是T细胞脂类代谢改变的关键酶。第二部分PLPP1调控CD8+T细胞的功能及代谢目的探讨PLPP1敲低后对活化的CD8+T细胞代谢及功能的直接影响。方法（1）通过流式细胞术,对比分析肺癌肿瘤组织部位PLPP1低表达和高表达的CD8+T细胞中功能分子（IFN-γ和TNF-α）的差异;同时构建恶性黑色素瘤小鼠模型,通过流式细胞术再次对比分析小鼠肿瘤组织部位PLPP1低表达和高表达的CD8+T细胞中功能分子（IFN-γ）和增殖相关分子（Ki67）的差异;（2）通过分子克隆技术构建PLPP1-sh质粒,转染健康人外周血来源的活化后的CD8+T细胞,并通过流式细胞术和RT-PCR法检测敲低效率,最后通过超高效液相色谱技术检测活化后的CD8+T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2CD8+T细胞中脂类分子类型和丰度;（3）通过RT-PCR法和海马能量检测技本分别检测活化后的CD8+ T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T细胞中代谢通路相关酶的表达,以及ECAR和OCR的代谢速率;（4）通过流式细胞术检测活化后的CD8+ T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T 细胞的增殖、凋亡、功能以及胞内 Ca2+浓度。结果（1）通过对比分析肺癌肿瘤组织部位PLPP1高表达和低表达的CD8+T细胞的功能,发现与PLPP1低表达的CD8+T细胞相比,PLPP1高表达的CD8+T细胞的功能较高;同时小鼠恶性黑色素瘤组织部位PLPP1高表达的CD8+T细胞的功能和增殖能力也明显高于PLPP1低表达的细胞;（2）CD8+T细胞活化后PLPP1的表达升高,通过分子克隆技术敲低活化的CD8+T细胞中PLPP1的表达,并对比分析PLPP1敲低后CD8+T细胞的代谢过程,发现PLPP1敲低后CD8+T细胞整体代谢水平均下调,其中磷脂代谢、糖酵解和脂肪酸合成代谢通路下调较为明显;（3）与对照组CD8+T细胞（未转染）相比,PLPP1-sh1和PLPP1-sh2CD8+T细胞凋亡比例没有明显变化,但是T细胞的增殖能力、杀伤功能和胞内Ca2+浓度均降低。PLPP1敲低后CD8+T细胞凋亡不受影响,但是T细胞增殖能力降低。结论PLPP1下调能够降低CD8+T细胞的磷脂代谢、糖酵解和脂肪酸合成代谢通路,并导致T细胞增殖、功能以及胞内Ca2+浓度下降,是调控CD8+T细胞代谢和功能的关键分子。第三部分PDL1/PD-1结合降低CD8+T细胞中PLPP1的表达目的探讨肿瘤微环境中调控CD8+T细胞中PLPP1表达的关键分子。方法（1）体外将健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞与肺癌肿瘤细胞系H460和A549共孵育,通过RT-PCR和流式细胞术检测共孵育后T细胞中PLPP1的表达,以及T细胞表面PD-1和肿瘤细胞表面PDL1的表达;（2）通过流式细胞术检测肺癌患者肿瘤组织中PLPP1高表达和低表达的活化CD8+T细胞表面共抑制分子（PD-1、CTLA4和Tim3）的表达差异;（3）体外活化健康人外周血来源的CD8+T细胞,并使用PDL1 Fc片段处理T细胞,通过成像流式和流式细胞术检测PDL1 Fc处理后CD8+T细胞PLPP1的表达;（4）通过分子克隆和细胞转染技术获得PLPP1敲低的CD8+T细胞,并使用PDL1 Fc片段处理,通过海马能量检测技术和流式细胞术检测PDL1 Fc处理后CD8+T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T细胞中OCR的代谢速率,细胞内线粒体功能变化,以及细胞功能和胞内Ca2+浓度变化;（5）构建小鼠恶性黑色素瘤模型并过继回输OT1T细胞,回输T细胞后分别在不同的时间点给予PDL1阻断型单抗治疗,通过RT-PCR和流式细胞术检测PDL1阻断型单抗治疗后小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的功能,以及PD-1高表达和不表达的CD8+T细胞中PLPP1的表达。结果（1）在肺癌患者的肿瘤微环境中发现PLPP1高表达的CD8+T细胞表面PD-1表达较低,而PLPP1低表达的CD8+T细胞中PD-1表达较高,这表明PD-1分子有可能调控CD8+T细胞中PLPP1的表达;（2）健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞与肺癌肿瘤细胞系H460和A549直接或间接共孵育,通过流式细胞术发现直接共孵育体系中CD8+T细胞表面PD-1的表达和肿瘤细胞系表面PDL1的表达显着升高,且该体系中CD8+T细胞中PLPP1的表达明显低于未孵育或间接共孵育的CD8+T细胞,该结果进一步表明了 PD-1可能调控CD8+T细胞中PLPP1的表达;（3）体外使用PDL1 Fc片段处理活化的CD8+T细胞以及PLPP1-sh1和PLPP1-sh2 CD8+T细胞,发现PDL1 Fc片段处理CD8+T细胞后细胞内OCR的代谢速率、胞内线粒体功能以及细胞功能和胞内Ca2+浓度均降低,但是处理PLPP1-sh1和PLPP1-sh2CD8+T细胞中OCR的代谢速率、胞内线粒体功能以及细胞功能和胞内Ca2+浓度没有明显变化,这表明PDL1/PD-1调控CD8+T细胞的代谢和功能主要依赖T细胞中PLPP1的表达;（4）PDL1阻断型单抗治疗小鼠恶性黑色素瘤后能够降低肿瘤细胞的生长速度,且进一步发现能够提高肿瘤微环境中抗原特异性T细胞中PLPP1的表达以及功能。结论肿瘤微环境中CD8+T细胞表面PD-1与其配体PDL1结合后,细胞内PLPP1的表达降低,进而导致T细胞代谢和功能的降低。第四部分PDL1/PD-1调控CD8+T细胞中PLPP1表达的分子机制目的探讨肿瘤微环境中PDL1/PD-1调控CD8+T细胞中PLPP1表达的主要信号通路。方法（1）体外使用PDL1 Fc处理健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞以及Jurkat和Jurkat-PD1细胞系,通过流式细胞术和Western blot技术检测PDL1 Fc处理后这些细胞中AKT/mTOR信号通路的变化;（2）通过PCR array和网站预测分析PDL1 Fc处理后健康人外周血来源的CD8+T细胞中转录因子的变化,同时通过体外敲低CD8+T细胞中相关转录因子检测细胞中PLPP1的表达变化;（3）通过Chip技术检测转录因子GATA1与靶基因PLPP1上游启动子区的结合,并进一步通过双荧光素酶实验验证GATA1是否能够与PLPP1的启动子区结合,从而调控该基因的表达;（4）GATA1调控目的基因的表达需要入核来发挥功能,通过成像流式和Western blot技术检测PDL1 Fc处理后CD8+T细胞中GATA1的核转位;（5）构建小鼠恶性黑色素瘤模型并过继回输OT1T细胞,通过小鼠成像技术检测肿瘤的生长并通过H&E染色证明肿瘤的生成;通过组织免疫荧光检测PDL1阻断型单抗治疗后小鼠的肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润以及PLPP1的表达;通过流式细胞术检测PDL1阻断抗体治疗后小鼠的肿瘤组织抗原特异性T细胞中AKT/mTOR信号通路的变化。结果（1）与Jurkat细胞系相比,Jurkat-PD1细胞系经过PDL1 Fc处理后AKT/mTOR信号通路受到明显抑制,同时PDL1 Fc片段处理健康人外周血来源的活化的CD8+T细胞后,T细胞中AKT/mTOR信号通路的活化也受到抑制,且PLPP1的表达降低;（2）CD8+T细胞经过PDL1 Fc片段处理后,细胞内共有14个转录因子发生变化,同时通过PROMO预测PLPP1启动子区的转录因子,最终发现差异转录因子中有5个可能调控PLPP1的转录因子（其中有2个转录因子在T细胞中表达水平很低,因此在后续实验中排除）,进一步通过敲低这些转录因子的表达发现GATA1是最有可能调控PLPP1表达的转录因子;（3）通过Chip实验发现GATA1能够与PLPP1启动子区的两个位点结合,且AKT抑制剂能够促进GATA1与PLPP1启动子区的结合,但是双荧光素酶实验发现GATA1只能够通过与PLPP1启动子区的site2位点结合,从而降低PLPP1的表达;（4）小鼠恶性黑色素瘤模型中PDL1阻断型单抗治疗后能够再次激活肿瘤组织部位CD8+T细胞中AKT/mTOR信号通路,从而提高肿瘤微环境中PLPP1+CD8+T细胞的浸润,降低肿瘤细胞的生长速度。结论PDL1/PD-1主要通过抑制CD8+T细胞中AKT/mTOR信号通路的活化,从而促进GATA1的核转位,最终导致PLPP1表达降低。
曾涵凌[6]（2019）在《ISET（微筛滤膜富集法）检测可手术乳腺癌循环肿瘤细胞的临床价值及可行性研究》文中研究说明背景乳腺癌是一种全身性疾病,大多数早期可手术患者的愈后较好。然而,一旦发生远处器官转移,乳腺癌将无法治愈,这是乳腺癌相关死亡的主要原因。部分乳腺癌患者的血液中可检测到一种稀有的非血液细胞,这些细胞从肿瘤原发灶脱落后通过血管、淋巴管进入血液循环,最终在初次手术和辅助治疗后导致肿瘤复发。这类细胞被称为循环肿瘤细胞,它们的数量极少,大约占有核血细胞的十亿分之一。通过可靠的检测技术收集乳腺癌患者循环肿瘤细胞,计数并进行分类,这些数据,对于乳腺癌患者的诊断、评估和预后具有越来越重要的价值。一级证据支持检测≥1循环肿瘤细胞作为非转移性乳腺癌的预后生物标志物的临床有效性,但是循环肿瘤细胞的检测方法仍然有待完善。其检测过程主要包括富集分离和标记鉴定两个步骤。鉴于循环肿瘤细胞的稀有性,有效的富集方法是检测质量的关键和难点。目前通常将富集方法分为阳性捕获和阴性富集两大类,各类根据阶段原理和技术的不同又分为若干种方法。这些方法的敏感性、特异性各有不同,可靠性、性价比各有千秋,现阶段均存在一定的局限性,在应用领域和适应症方面仍在不断的探索和进步。上皮肿瘤细胞大小分离法（ISET）的改良版微筛滤膜富集法虽然在基础原理上存在对于小细胞亚群的漏检,但是具有步骤少,操作简单,同质性强的特点,对于反映细胞丰度的大规模临床检测具有实用价值。改良的微筛滤膜富集法在早期乳腺癌的血液检测中的价值尚没有定论,本研究旨在探索该方法在可手术乳腺癌中的检出率,评估检出率及细胞计数与乳腺癌分子分型、病理分期分级等临床因素的相关性,为该技术在可手术乳腺癌人群的临床应用可行性提供基础数据。方法本次实验纳入,术前取得病理确诊,接受手术的193名乳腺癌患者。术前留取静脉血10ml,并用ISET技术对他们血液样本中的循环肿瘤细胞进行计数分析。结果193名接受手术的乳腺癌患者,用ISET法检测循环肿瘤细胞的总检出率为41.24%。随后按照病理类型、组织学分级、肿瘤（T）分期、淋巴结转移、激素受体状态、Her-2状态、Ki-67状态等分组,逐一分析每组中的检出率、总循环肿瘤细胞数、平均循环肿瘤细胞数。最终结果显示上述各亚组之间各数值差异均没有明显统计学意义。另外,患者中包括了男性乳腺癌1例、组织学I级1例,分别在其血液中检出了循环肿瘤细胞。结论ISET法对于乳腺癌患者有相对较好的检出率,但是ISET法不能对病理分期、分子分型等方面提供更多的信息。部分亚类因样本量不足,不能确定ISET法对它们的临床意义。
刘婷[7]（2019）在《GeneXpert MTB/RIF在系统性自身免疫病合并肺结核患者中的应用》文中提出目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测体系（Gene Xpert MTB/RIF）诊断系统性自身免疫病（Systemic Autoimmune Diseases,SAD）合并肺结核（Pulmonary Tuberculosis,PTB）患者中的应用价值,为SAD合并PTB的临床诊断提供参考。方法选取2017年1月-2018年3月枣庄市立医院和山东省胸科医院收治的SAD合并PTB的350例患者作为观察组,选取同期患有SAD的非结核的50例患者作为对照组。采集所有入选者的痰液标本,每份标本分成3份,分别采用抗酸染色法、BACTECTMMGITTM960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪（MGIT960液体培养）和GeneXpert MTB/RIF技术检测3份痰液标本;另外采集所有入选者全血5ml,采用T细胞斑点试验（T-cell dot test,T-SPOT）进行检测。以临床诊断和影像学检查作为系统性自身免疫病合并肺结核诊断的金标准,计算GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液体培养、T-SPOT法和抗酸染色法对不同系统性自身免疫病中肺结核的检出率,并比较GeneXpert MTB/RIF与MGIT960液体培养、T-SPOT法和抗酸染色法的灵敏度和特异度;以结核杆菌液体药敏试验作为金标准,分析GeneXpert MTB/RIF在检测利福平耐药性中的价值;比较GeneXpert MTB/RIF系统半定量结果与MGIT960液体培养、T-SPOT法、抗酸染色法细菌计数。结果（1）在系统性血管炎中,与MGIT960液体培养和抗酸染色法的结核病检出率相比,GeneXpert MTB/RIF的检出率明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;在系统性红斑狼疮、皮肌炎、混合性结缔组织病中,与MGIT960液体培养和抗酸染色法的结核病检出率相比,GeneXpert MTB/RIF的检出率明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;在硬皮病、干燥综合征中,与抗酸染色法的结核病检出率相比,GeneXpert MTB/RIF的检出率明显增高,差异有统计学意义（P<0.05）;在类风湿性关节炎中,与T-SPOT法和抗酸染色法的结核病检出率相比,GeneXpert MTB/RIF的检出率明显增高,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液体培养、T-SPOT法和抗酸染色法在检测SAD合并肺结核方面的灵敏度分别为95.14%、84.00%、89.71%和56.86%,GeneXpert MTB/RIF检测的灵敏度与MGIT960液体培养、T-SPOT法有较好的一致性（χ2=1.73、1.39,P>0.05）,明显高于抗酸染色法（χ2=36.60,P<0.05）;GeneXpert MTB/RIF检测的特异度与MGIT960液体培养、抗酸染色法有较好的一致性（χ2=1.42、0.15,P>0.05）,明显高于T-SPOT法（χ2=17.53,P<0.05）。（3）GeneXpert MTB/RIF对350例患者中的156例进行利福平耐药性检测,结果显示,GeneXpert MTB/RIF检出利福平耐药53例,灵敏度为86.00%,特异度为90.56%。（4）GeneXpert MTB/RIF系统检测结核菌的结果分为未检出、极低、低、中和高5个量级。在未检出量级中,与MGIT960液体培养、T-SPOT法的结核菌检出率相比,GeneXpert MTB/RIF系统的检出率明显降低,差异有统计学意义（χ2=4.026、5.835,P<0.05）;在极低、低2个量级中,与MGIT960液体培养、T-SPOT法、抗酸染色法的结核菌检出率相比,GeneXpert MTB/RIF系统的检出率明显增高,差异有统计学意义（χ2=5.172-18.935,P<0.05）;在高量级中,与MGIT960液体培养、T-SPOT法的结核菌检出率相比,GeneXpert MTB/RIF系统的检出率均明显增高,差异有统计学意义（χ2=4.374、4.286,P<0.05）。结论（1）GeneXpert MTB/RIF是一种快速、准确诊断系统性自身免疫病合并肺结核及利福平耐药性的方法,对不同系统性自身免疫病合并肺结核的早期诊断具有临床意义。（2）与传统的MGIT960液体培养、T-SPOT法和抗酸染色法等联合,可显着提高合并肺结核系统性自身免疫病结核病的检出率。
林树春[8]（2019）在《Treg、MDSC及PD-1阳性T细胞在头颈部鳞状细胞癌免疫抑制机制的研究》文中研究指明目的1.探讨HNSCC微环境中各种抑制细胞的作用,并且评估其相互作用及关系。2.研究HNSCC免疫抑制网络中主要组成部分Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞相互联系、共同抑制机制问题。3.评估HNSCC局部及外周环境中效应性T细胞功能状态,阐述其中的原因及功能恢复机制,探讨免疫治疗的多靶点联合治疗的可行性。方法1.分离外周血PBMC,使用Ficoll密度梯度离心法分离HNSCC组与健康成年组的外周血PBMC,通过多通道荧光流式细胞仪检测PBMC中Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞,并进行定量分析,Treg的标志为CD4+CD25+Fox P3+GARP+CTLA-4+Treg,T细胞的标志为CD4+PD-1+/CD8+PD-1+T,MDSC的标志为CD14-HLA-DR-CD11b+CD33+MDSC。2.分离肿瘤TILs,手术切除HNSCC标本用来做癌细胞和TILs分离。使用Ficoll密度梯度离心法分离TILs与肿瘤细胞。同法通过多通道荧光流式细胞仪检测TILs中Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞。3.检测外周血PBMC、血清及肿瘤组织中TILs的IL-10、TGF-β1、INF-γ、颗粒酶B的表达,分别使用ELISA、流式细胞术的方法检测。4.筛选免疫耐受型病例即PD-L1和TILs双阳性病例,观察肿瘤组织中PD-L1与TILs的表达情况,应用免疫组化方法检测连续切片中PD-L1、CD3、CD8、Foxp3、CD11b、CD33、CD68抗体染色,检查肿瘤组织及周围基质中Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞,总结、分析其表达类型。结果1.HNSCC中的Treg呈现高免疫抑制性表型。HNSCC患者TILs及外周血中的CD4+Foxp3+Tregs比例明显增加,其中CTLA4+Foxp3+Tregs、GARP+Foxp3+Tregs表型均有不同程度的升高,与正常对照外周血比较,差别均有显着性意义。2.HNSCC患者MDSCs比例提高,并且与CD4+Foxp3+Tregs升高呈正相关性。HNSCC患者TILs及外周血中的MDSCs比例明显增加,较正常扁桃体组织、正常对照外周血中的含量均有明显的增多,差别均有显着性意义。%CD4+Foxp3+Treg升高与%MDSC升高之间呈相关性,其中HNSCC-TILs中%CD4+Foxp3+Treg升高与%MDSC升高之间呈强相关。3.HNSCC患者CD4+及CD8+T细胞PD-1表达均增加。HNSCC患者TILs及外周血中的PD-1+CD4+T细胞及PD-1+CD8+T细胞比例均增加,较正常对照外周血中的含量均有明显的增多,差别均有显着性意义。4.HNSCC患者抗肿瘤细胞因子减少,免疫抑制性细胞因子水平提升。HNSCC患者外周血中的IFN-γ含量减少,较正常对照外周血中的含量均有明显的减少,差别有显着性意义。HNSCC患者外周血中的IL-10和TGF-β1水平含量增加,较正常对照外周血中的含量均有明显的增加,差别有显着性意义。CD4+Foxp3+Treg比例升高与高血浆水平TGF-β1之间呈相关性。5.HNSCC体内CD8+CTL细胞杀伤功能活性下降。HNSCC患者TILs的CD8+T细胞中GB明显受到抑制,含量明显减少,比正常对照外周血、HNSCC外周血及正常扁桃体组织中的含量均有明显的减少,差别均有显着性意义,HNSCC外周血PBMC与正常对照外周血PBMC比较没有明显减少,差别没有显着性意义。6.HNSCC肿瘤微环境中肿瘤PD-L1表达与TILs中免疫细胞形成免疫抑制网络。PD-L1在HNSCC肿瘤细胞主要呈膜性表达,23/32例（71.7%）显示PD-L1染色阳性。大部分的标本（22/23）显示染色局限于癌巢和炎性基质之间界面的肿瘤边缘,只有1/23例显示癌巢内的弥漫性PD-L1表达。TILs中同时检测到CD4+T细胞、CD8+T细胞、Fox P3+Treg、MDSC及CD68+TAM细胞,它们构成TILs的主要成分,肿瘤细胞、CD68+TAM与T细胞形成接触性PD-L1:PD-1共抑制机制,Fox P3+Treg、MDSC可能在非PD-L1:PD-1免疫抑制机制中发挥主要作用。结论1.HNSCC中Fox P3+GARP+CTLA4+Treg,MDSC,PD-1+T细胞比例相互增加,IFN-γ减少及相应IL-10和TGF-β1增加,这些因素相互联系、相互作用,是组成HNSCC局部免疫抑制网络的主要部分。2.HNSCC伴随明显的TILs浸润,明显的炎性微环境是头颈鳞癌的重要特点,TILs的炎性免疫反应可能构成肿瘤微环境免疫抑制的主要原因,促进肿瘤的发生、发展。3.大部分肿瘤的肿瘤细胞、CD68+TAM在局部接触T细胞诱导形成PD-1:PD-L1免疫抑制通路,而Treg增加并伴随MDSC相应的增多,也直接抑制CD8+CTL的杀肿瘤效应,形成非PD-1:PD-L1免疫抑制机制。4.GARP可能是消除Treg的一个理想的候选靶点。5.HNSCC肿瘤免疫治疗的重点在局部免疫微环境,联合消除HNSCC肿瘤局部的Treg、MDSC、PD-1+T细胞抑制联系,可以有效解除局部肿瘤微环境的免疫抑制,进一步加强内源性抗肿瘤反应将来有必要采取“科学组合”或“联合治疗”策略。
王杰钦[9]（2018）在《用于肝癌个体化治疗的三维药敏试验方法研究》文中认为背景:肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在全球所有恶性肿瘤相关死因中高居第二位。化疗是肝癌非手术治疗最常用的方法,然而目前仍然没有明确的证据表明任何一种化疗方案优于其他方案。由于肿瘤异质性的广泛存在,临床医生在选用化疗方案时往往仅凭个人经验,导致肝癌化疗疗效的不确定性,有关资料显示肝癌经验性化疗的有效率甚至不足30%。在“精准医疗”（precision medicine）模式的推动下,肝癌个体化治疗越来越受到人们的重视。而一系列临床研究也相继证实了肿瘤药敏试验（chemosensitivity test,CST）对于肝癌个体化治疗具有重要的指导意义。然而,由于缺乏高级别的临床证据,人们对肿瘤药敏试验应用于临床实践依旧持谨慎的态度。传统的肝癌药敏试验大多采用二维培养法,不能很好地模拟肿瘤细胞在体内的微环境,使得药敏试验结果无法真实反映肝癌患者对化疗药物的敏感性。另一方面,肝癌药敏试验缺乏统一的技术标准,各研究中心的药敏结果评判标准各不相同,极大地限制了肝癌药敏试验的推广。鉴于此,一种基于三维培养系统的、采用准确可靠的药敏评判标准的药敏试验方法是肝癌个体化治疗未来的一大研究方向。目的:发明一种成本较低、简单易行、稳定可靠的三维药敏试验方法,为肝癌个体化化疗提供重要指导。方法:第一章三维培养系统的构建与评价以商品化的三维培养系统GravityPLUS和AggreWell为借鉴设计模具,并用SOLIDWORKS 2016软件绘制倒模图,通过应用3D打印技术和注塑法构建三维培养系统。然后用三维培养系统对C3A细胞进行聚球培养,同时以二维培养组作为对照,动态观察两组细胞的形态学变化及检测其白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、乳酸脱氢酶（LDH）水平。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验采用胶原酶消化法和Percoll密度梯度离心法分离和纯化人原代肝癌细胞,并用台盼蓝拒染法和免疫荧光染色进行计数和鉴定。用第一章构建的三维培养系统对分离得到的人原代肝癌细胞进行聚球培养,同时以二维培养组作为对照,动态观察两组细胞的形态学变化。最后分别用八种化疗方案处理两组细胞,并用CCK-8法检测细胞活力,通过敏感度分级、敏感指数和联合指数三个指标对药敏结果进行综合评价。结果:第一章三维培养系统的构建与评价制作的PDMS模具具有良好的均一性,微孔均呈球形,无明显锯齿化。C3A细胞在接种三天后即可聚集成球,细胞球直径因接种密度而异,最终可占满整个微孔达到400μm。对C3A细胞的功能动态检测显示三维培养组的ALB、BUN水平明显高于二维培养组,反映三维培养组的合成功能和解毒功能优于二维培养组;而作为肝功能损害敏感指标的ALT、AST和LDH水平三维培养组总体低于二维培养组。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验成功分离的两例人原代肝癌细胞活率和纯度分别大于90%和85%。两例人原代肝癌细胞在接种至三维培养系统三天后即可聚集成球,且绝大多数散在细胞均能迁移至微孔中,成球效果明显优于C3A细胞。药敏结果显示,对于第一例人原代肝癌细胞（ID:2652968）,二维培养组对ADM+DDP的联合方案最敏感,而三维培养组对八种方案均耐药;对于第二例人原代肝癌细胞（ID:2685241）,二维培养组对ADM+DDP的联合方案最敏感,而三维培养组对GEM+OXA最敏感。结论:本课题通过应用3D打印技术和注塑法构建的三维培养系统优于传统二维培养系统,尤其适合人原代肝癌细胞的聚球培养。结合CCK-8法和敏感度分级、敏感指数及联合指数三个指标能够很好地评价人原代肝癌细胞对不同药物的敏感性。在我们的实验中,人原代肝癌细胞二维及三维药敏结果存在较大差异,三维培养组对同一化疗方案的敏感性普遍低于二维培养组,与文献报道相符。该肝癌三维药敏试验方法具有成本低廉、操作简便、可重复利用、成球效果良好、适合高通量药物筛选等优点,提高了检测的准确性和稳定性,能够更合理地指导临床科学用药,为肝癌个体化治疗提供重要参考。
宋丹[10]（2017）在《ATP-TCA、常见耐药基因表达与Ⅰb2-Ⅱb期宫颈癌新辅助化疗近期疗效的相关性研究》文中研究指明【目的】评价ATP-TCA结果、常见耐药基因表达与Ⅰb2-Ⅱb期宫颈癌新辅助化疗近期疗效的关系;研究联合ATP-TCA法和常见耐药基因检测两种方法预测宫颈癌化疗敏感性的可行性,为进一步临床应用研究提供依据。【方法】收集接受治疗前的Ⅰb2-Ⅱb期宫颈鳞癌患者的新鲜肿瘤组织标本100例,采用ATP-TCA法对宫颈癌细胞进行PTX、CBP和PTX+CBP三种方案的体外药物敏感性检测。同时采用EnVision免疫组化检测其中95例宫颈癌标本的P-gp、GST-π、TopoⅡ和TS四种蛋白的表达。患者取材后即采用PTX+CBP治疗,静脉全身给药,共化疗两程,两程间隔3周,2-3周后观察患者近期疗效。观察95例宫颈癌患者新辅助化疗后的近期疗效。统计分析两种方法的检测结果和临床近期疗效的关系;常见耐药基因表达与ATP-TCA结果的相关性;两种检测方法联合预测临床化疗敏感性的可行性。【结果】（1）100例宫颈癌标本中最终有95例纳入研究。95例患者经新辅助化疗后达到CR的患者5例,PR的患者68例,SD的患者21例,PD的患者1例。近期疗效有效率（CR+PR）为76.84%（73/95）。（2）ATP-TCA法的可评价率为95%,PTX+CBP的体外有效率达80%。将ATP-TCA结果与近期疗效进行相关性分析,结果显示PTX+CBP的ATP-TCA结果与近期疗效具有显着相关性（P<0.05）,其近期疗效符合率为86.32%。其预测临床化疗敏感性的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为93.15%、63.64%、89.47%和73.68%。（3）耐药蛋白P-gp、GST-π、TopoⅡ和TS阳性表达分别为:40例（42.11%）、27例（28.42%）、32例（33.68%）和53例（55.79%）。将免疫组化结果与近期疗效进行相关性分析,P-gp、GST-π和TopoⅡ表达情况差异与近期疗效之间有统计学意义（P<0.05）,GST-π的表达情况与近期疗效符合率最高,为75.79%。其预测临床化疗敏感性的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为80.82%、59.09%、86.76%和48.15%。（4）比较PTX+CBP的ATP-TCA结果与耐药蛋白表达的相关性,仅耐药蛋白GST-π和ATP-TCA结果有相关性（P<0.05）。其与ATP-TCA体外药敏结果的符合率达81.05%。（5）联合应用PTX+CBP的ATP-TCA结果和耐药基因表达指标,耐药蛋白GST-π、TopoⅡ和TS表达联合体外药敏和近期疗效有相关性（P<0.05）,耐药蛋白GST-π表达联合体外药敏和近期疗效符合率最高,为87.37%。【结论】PTX+CBP的ATP-TCA结果与近期疗效有相关性,其近期疗效符合率为86.32%;耐药蛋白P-gp、GST-π和TopoⅡ与近期疗效有相关性,其中GST-π与近期疗效符合率最高为75.79%;耐药蛋白GST-π、TopoⅡ和TS联合体外药敏和近期疗效有相关性,其中GST-π联合体外药敏和近期疗效符合率最高为87.37%。提示ATP-TCA法、耐药基因表达可能用于宫颈癌药物敏感性检测。联合应用ATP-TCA结果和耐药蛋白GST-π表达指标,其结果与近期疗效符合率高于单独ATP-TCA法或单独耐药基因检测。提示ATP-TCA法联合耐药蛋白GST-π表达结果可能可以预测宫颈癌的临床化疗敏感性,从而为进一步临床研究提供依据。
二、梯度离心法在肿瘤药敏试验中的应用及临床相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、梯度离心法在肿瘤药敏试验中的应用及临床相关性研究（论文提纲范文）
（1）口蹄疫灭活抗原稳定性及灭活疫苗效力检验替代方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词 |
| 第一章:综述 |
| 1.口蹄疫研究概况 |
| 1.1 口蹄疫的特点及历史分布 |
| 1.2 口蹄疫的危害 |
| 1.3 口蹄疫的防制 |
| 1.4 口蹄疫疫苗生产质量控制技术 |
| 1.5 口蹄疫灭活疫苗效力检验替代实验研究现状 |
| 1.5.1 其它试验动物替代法 |
| 1.5.2 血清学实验替代法 |
| 1.5.3 疫苗有效抗原含量定量法 |
| 1.5.3.1 蔗糖密度梯度离心法 |
| 1.5.3.2 氯化铯密度梯度离心法 |
| 1.5.3.3 补体结合试验 |
| 1.5.3.4 单克隆抗体夹心ELISA定量 |
| 1.5.3.5 实时荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.5.3.6 分子排阻色谱法 |
| 1.5.3.7 蛋白层析法 |
| 1.5.3.8 其他方法 |
| 1.6 口蹄疫灭活抗原的稳定性研究进展 |
| 1.7 总结和展望 |
| 2.细胞因子的研究概况 |
| 第二章 四种检测口蹄疫146S抗原含量方法的比较研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 试剂与溶液 |
| 2.3 口蹄疫抗原 |
| 3.方法 |
| 3.1 蔗糖密度梯度离心结合紫外分光光度计定量法 |
| 3.2 蔗糖密度梯度离心结合液相色谱仪定量法 |
| 3.3 高效液相体积排阻色谱法 |
| 3.4 ELISA检测法 |
| 3.4.1 试剂准备 |
| 3.4.2 检测步骤 |
| 3.4.3 结果计算 |
| 3.5 四种检测方法的相关性实验 |
| 3.6 四种检测方法的重复性验证 |
| 4.结果 |
| 4.1 用紫外分光光度计定量法和液相色谱仪定量法各测得30份抗原样品146S含量结果 |
| 4.2 紫外分光光度计定量法和液相色谱仪定量法测得数据相关性结果 |
| 4.3 液相色谱仪定量法和高效液相体积排阻色谱法测得数据以及相关性结果 |
| 4.4 液相色谱仪定量法和ELISA检测法测得数据以及相关性结果 |
| 4.5 蔗糖密度梯度离心结合紫外分光光度计定量法重复检测同一抗原样品20次结果 |
| 4.6 蔗糖密度梯度离心结合液相色谱仪定量法重复检测同一抗原样品50 次结果 |
| 4.7 高效液相体积排阻色谱法检测口蹄疫146S抗原定量分析标准曲线 |
| 4.8 高效液相体积排阻色谱法重复检测同一抗原样品20 次结果 |
| 4.9 ELISA检测法重复检测同一抗原样品20 次结果 |
| 5.讨论 |
| 第三章 口蹄疫抗原稳定性的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 试剂与溶液 |
| 2.3 口蹄疫抗原 |
| 3.方法 |
| 3.1 蔗糖密度梯度离心结合液相色谱仪定量法 |
| 3.2 口蹄疫抗原稳定性实验 |
| 3.3 利用全能核酸酶去除核酸杂质干扰的实验 |
| 3.4 各型口蹄疫抗原裂解试验 |
| 4.结果 |
| 4.1 口蹄疫抗原稳定性实验 |
| 4.2 全能核酸酶处理前后抗原检测结果 |
| 4.2.1 液相色谱仪定量法检测的未加全能核酸酶处理的抗原检测图 |
| 4.2.2 液相色谱仪定量法检测的加全能核酸酶处理后的抗原检测图 |
| 4.2.3 高效液相体积排阻色谱法检测的未加全能核酸酶处理的抗原检测图 |
| 4.2.4 高效液相体积排阻色谱法检测的加全能核酸酶处理后的抗原检测图 |
| 4.3 四种口蹄疫抗原不同时间段裂解后的样品每毫升抗原146S含量 |
| 5.讨论 |
| 第四章 口蹄疫灭活疫苗效力检验替代方法研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 试剂与溶液 |
| 2.3 口蹄疫疫苗 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 实验场所 |
| 3.方法 |
| 3.1 疫苗破乳及抗原处理 |
| 3.2 用高效液相体积排阻色谱法检测疫苗中146S含量 |
| 3.2.1 色谱流动相配制 |
| 3.2.2 仪器设定 |
| 3.2.3 标准曲线绘制 |
| 3.2.4 结果计算 |
| 3.3 口蹄疫O型、A型 ELISA抗原检测试剂盒检测各型抗原有效抗原含量 |
| 3.3.1 试剂准备 |
| 3.3.2 检测步骤 |
| 3.3.3 实验成立条件 |
| 3.3.4 结果计算 |
| 3.3.5 注意事项 |
| 3.4 动物效力检验 |
| 3.4.1 检验毒种对猪ID_(50)的测定 |
| 3.4.2 检验毒种对豚鼠ID_(50)的测定 |
| 3.4.3 猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗对猪的效力试验 |
| 3.4.4 猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗对豚鼠的效力试验 |
| 3.4.5 口蹄疫液相阻断ELISA检测免疫后猪的抗体 |
| 3.4.6 ELISA检测免疫后猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10 的动态变化 |
| 4.结果 |
| 4.1 高效液相体积排阻色谱法定量分析标准曲线 |
| 4.2 口蹄疫疫苗中146S含量色谱图 |
| 4.3 高效液相体积排阻色谱法及口蹄疫 O 型、A 型 ELISA 抗原检测试剂盒检测的三批试验疫苗中 146S 有效抗原含量 |
| 4.4 检验毒种对猪ID_(50)的测定结果 |
| 4.5 检验毒种对豚鼠ID_(50)的测定结果 |
| 4.6 三批试验疫苗对猪的免疫效力试验(PD_(50)测定)结果 |
| 4.7 三批试验疫苗对豚鼠的免疫效力试验(PD_(50)测定)结果 |
| 4.8 免疫后猪血清中细胞因子的检测结果 |
| 4.8.1 猪血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.8.2 猪血清中IL-10 检测结果 |
| 4.8.3 猪血清中IL-4 检测结果 |
| 4.9 疫苗中146S含量与攻毒保护率的相关性分析 |
| 4.10 猪血清抗体效价与攻毒保护率的相关性分析 |
| 4.11 豚鼠攻毒保护率与猪攻毒保护率的相关性分析 |
| 5.讨论 |
| 6.全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 1型糖尿病免疫系统异常概述 |
| 2.1.1 适应性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.2 先天性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.3 免疫治疗在1型糖尿病中的应用 |
| 2.2 SLAM分子家族在免疫系统异常疾病中的表达 |
| 2.2.1 SLAM分子家族概述 |
| 2.2.2 SLAM分子家族在多种疾病中异常表达 |
| 2.3 SLAMF4(CD244)研究现状综述 |
| 2.3.1 SLAMF4(CD244)的结构与功能 |
| 2.3.2 SLAMF4(CD244)的异常表达与疾病 |
| 2.3.3 SLAMF4(CD244)的应用前景与展望 |
| 第3章 T1DM患者免疫系统变化及SLAM分子家族表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 人外周血来源 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 3.3.2 生化的测定 |
| 3.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 3.3.4 细胞外标志物染色 |
| 3.3.5 细胞内Foxp3 染色 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 T1DM患者及HCs基线指标及生化检测结果 |
| 3.4.2 T1DM患者及HCs外周血PBMC中T细胞表达 |
| 3.4.3 T1DM患者及HCs外周血PBMC中B细胞表达 |
| 3.4.4 T1DM患者及HCs外周血PBMC中NK细胞表达 |
| 3.4.5 T1DM患者及HCs外周血PBMC中髓系细胞表达 |
| 3.4.6 各免疫细胞表面SLAM分子家族表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 T1DM患者T细胞表面SLAMF4 分子表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 人外周血来源 |
| 4.2.2 材料和试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.3.2 生化及一般临床资料的测定 |
| 4.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 4.3.4 细胞外标志物染色 |
| 4.3.5 细胞内IFN-γ/TNF-a染色 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 T1DM患者及HCs外周血T细胞SLAMF4分子表达 |
| 4.4.2 T1DM患者及HCs外周血T细胞亚群SLAMF4分子表达 |
| 4.4.3 SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关 |
| 4.4.4 T1DM患者外周血SLAMF4分子表达与一般临床资料相关性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 NOD小鼠免疫细胞分化及SLAMF4分子表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和动物 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 垫料与饲料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 NOD小鼠体重及一般情况 |
| 5.3.2 NOD小鼠血糖的测量 |
| 5.3.3 检测小鼠外周血免疫细胞分化及血清分离 |
| 5.3.4 胰腺淋巴结单细胞悬液制备 |
| 5.3.5 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 5.3.6 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞 |
| 5.3.7 细胞外标志物染色 |
| 5.3.8 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin stain,HE)染色 |
| 5.3.9 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 NOD小鼠1型糖尿病发病情况 |
| 5.4.2 NOD小鼠外周血T细胞亚群分布异常 |
| 5.4.3 NOD小鼠T细胞表面SLAMF4分子异常表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 SLAMF4调控CD8~+T细胞的增殖与凋亡 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 人脐带血来源 |
| 6.2.2 正常人外周血来源 |
| 6.2.3 T1DM患者外周血来源 |
| 6.2.4 材料与试剂 |
| 6.2.5 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞 |
| 6.3.2 磁珠分选脐带血CD8~+T细胞 |
| 6.3.3 体外培养脐带血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.4 流式分选T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞转录组测序 |
| 6.3.5 磁珠分选正常人外周血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.6 流式分选正常人SLAMF4~+CD8+T细胞及SLAMF4~-CD8+T细胞 |
| 6.3.7 细胞凋亡检测 |
| 6.3.8 细胞增殖检测 |
| 6.3.9 统计分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 体外培养脐带血来源CD8~+T细胞SLAMF4表达情况 |
| 6.4.2 T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞的RNA测序 |
| 6.4.3 SLAMF4与CD8+T细胞凋亡 |
| 6.4.4 SLAMF4与CD8+T细胞增殖 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 T1DM免疫损伤机理及SLAMF分子异常表达的思考 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）金葡菌噬菌体的筛选及对小鼠乳腺炎的抑制作用与机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 奶牛乳腺炎研究进展 |
| 1.1.1 奶牛乳腺炎的分类与研究现状 |
| 1.1.2 诱发奶牛乳腺炎的原因 |
| 1.1.3 奶牛乳腺炎的产生机制 |
| 1.1.4 金黄色葡萄球菌相关研究 |
| 1.1.5 常见的奶牛乳腺炎治疗方法 |
| 1.2 噬菌体的发现、分类及生物学特性 |
| 1.2.1 噬菌体发展历史与现况 |
| 1.2.2 噬菌体的形态与结构多样性 |
| 1.2.3 有尾噬菌体目的分类 |
| 1.2.4 噬菌体的侵染周期 |
| 1.3 噬菌体疗法及其对奶牛乳腺炎的防控 |
| 1.3.1 噬菌体疗法概述 |
| 1.3.2 噬菌体对金葡菌的治疗 |
| 1.3.3 噬菌体疗法的局限性 |
| 1.4 本论文的选题依据和研究内容 |
| 2 奶牛乳腺炎致病菌及其噬菌体的分离纯化与生物学特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器与设备 |
| 2.2.4 培养基和实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 奶样的采集 |
| 2.3.2 病原菌的分离纯化 |
| 2.3.3 细菌的生理生化鉴定 |
| 2.3.4 分离株的药敏分析 |
| 2.3.5 分子生物学鉴定 |
| 2.3.6 半数致死量(LD_(50))试验 |
| 2.3.7 噬菌体的分离及纯化 |
| 2.3.8 噬菌体的效价检测 |
| 2.3.9 噬菌体的最佳感染复数测定 |
| 2.3.10 噬菌体的扩增与培养 |
| 2.3.11 噬菌体颗粒的提纯与去杂质 |
| 2.3.12 噬菌体透射电镜观察 |
| 2.3.13 噬菌体宿主谱的测定 |
| 2.3.14 氯仿敏感性测试 |
| 2.3.15 噬菌体温度稳定性测定 |
| 2.3.16 噬菌体pH值稳定性测定 |
| 2.3.17 噬菌体一步生长曲线 |
| 2.3.18 噬菌体对金葡菌生长的影响 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 奶样质地与病原菌菌落形态 |
| 2.4.2 病原菌检测结果 |
| 2.4.3 病原菌理化性质 |
| 2.4.4 金葡菌的药敏检测结果 |
| 2.4.5 金葡菌16s和系统发育树 |
| 2.4.6 金葡菌Sau-XJ-21的半数致死量 |
| 2.4.7 金葡菌Sau-XJ-21的裂解性噬菌体形态 |
| 2.4.8 噬菌体的宿主谱范围 |
| 2.4.9 噬菌斑形态特征 |
| 2.4.10 噬菌体透射电镜形态 |
| 2.4.11 噬菌体最佳感染复数 |
| 2.4.12 噬菌体对氯仿的敏感性 |
| 2.4.13 噬菌体的温度稳定性 |
| 2.4.14 噬菌体的pH稳定性 |
| 2.4.15 噬菌体的一步生长曲线 |
| 2.4.16 噬菌体的体外抑菌效应 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 噬菌体vBSM-A1和vBSP-A2的全基因组测序与注释 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 菌株与噬菌体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 培养基和实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 噬菌体的纯化与浓缩 |
| 3.3.2 CsCl等密度梯度离心及回收 |
| 3.3.3 噬菌体基因组的提取 |
| 3.3.4 噬菌体的全基因组测序 |
| 3.3.5 噬菌体的全基因组分析和功能注释 |
| 3.3.6 噬菌体的主要功能基因比对与进化分析 |
| 3.3.7 噬菌体裂解酶蛋白结构分析 |
| 3.3.8 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 噬菌体的基本生物学信息 |
| 3.4.2 噬菌体的基因分布 |
| 3.4.3 噬菌体的功能基因预测结果 |
| 3.4.4 噬菌体vBSM-A1的全基因蛋白图谱 |
| 3.4.5 噬菌体vBSP-A2的全基因蛋白图谱 |
| 3.4.6 噬菌体tRNA形态结构 |
| 3.4.7 噬菌体的分类学地位 |
| 3.4.8 裂解酶的跨膜区域和信号肽 |
| 3.4.9 裂解酶疏水性及理化性质 |
| 3.4.10 裂解酶二级结构 |
| 3.4.11 裂解酶三级结构 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 噬菌体抑制金黄色葡萄球菌的效果研究及安全性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 仪器与设备 |
| 4.2.2 主要培养基及试剂 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 实验菌株与噬菌体的培养纯化 |
| 4.3.2 小鼠乳腺炎模型的建立与评估 |
| 4.3.3 噬菌体cocktail治疗小鼠乳腺炎的分析 |
| 4.3.4 噬菌体安全性实验及转录组分析 |
| 4.3.5 数据统计与分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 小鼠乳腺炎模型的建立 |
| 4.4.2 噬菌体cocktail对小鼠乳腺炎的治疗结果 |
| 4.4.3 噬菌体cocktail治疗对小鼠肠道菌群的影响 |
| 4.4.4 噬菌体安全性检测及转录组分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 噬菌体ORF在线预测结果 |
| 附录B 裂解酶的3D模型 |
| 附录C 噬菌体cocktail治疗小鼠的血常规结果 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）糖基转移酶Fut8影响CD8+T细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 CD8~+T细胞活化过程中糖基化修饰酶编码基因的染色质可及性和转录全景式分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 糖基化修饰酶Fut8对CD8~+T细胞功能以及PD-1表达的影响研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 利用动物模型及临床样本验证Fut8对CD8~+T细胞的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫检查点PD-1 表达的调控机制研究及现状 |
| 前言 |
| 1 免疫检查点在肿瘤治疗中的发展历史及影响 |
| 2 PD-1的结构及功能特征 |
| 3 PD-1的表达调控 |
| 4 PD-1在肿瘤治疗中的新发现 |
| 5 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）PD-1调控肿瘤微环境CD8+T细胞磷脂代谢重编程及功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 实体瘤肿瘤微环境中CD8~+ T细胞磷脂代谢降低 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肿瘤微环境中T细胞功能耗竭 |
| 3.2 肿瘤微环境中T细胞脂代谢异常 |
| 3.3 TIL中活化的CD8~+ T细胞中磷脂代谢相关酶PLPP1表达下调 |
| 3.4 PLPP1表达与T细胞增殖及活化具有相关性 |
| 3.5 其他实体肿瘤组织中PLPP1表达降低且与预后相关 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PLPP1调控CD8~+ T细胞的功能及代谢 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肿瘤微环境中PLPP1~(high) CD8~+T细胞功能较强 |
| 3.2 PLPP1敲低的CD8~+T细胞磷脂代谢过程减弱 |
| 3.3 PLPP1敲低的CD8~+T细胞整体代谢水平降低 |
| 3.4 PLPP1敲低的CD8~+T细胞增殖能力减弱 |
| 3.5 PLPP1敲低的CD8~+ T细胞功能降低 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PDL1/PD-1结合降低CD8~+ T细胞中PLPP1的表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PDL1/PD-1结合降低CD8~+T细胞中PLPP1的表达 |
| 3.2 PDL1 Fc片段降低CD8~+T细胞中PLPP1的表达及功能 |
| 3.3 PDL1 Fc片段调控CD8~+T细胞代谢及功能主要依赖PLPP1表达 |
| 3.4 PDL1单抗治疗恢复了肿瘤微环境中抗原特异性T细胞中PLPP1的表达并恢复其杀伤功能 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 PDL1/PD-1调控CD8~+T细胞中PLPP1表达的分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PDL1/PD-1结合激活CD8~+T细胞中AKT/mTOR信号通路 |
| 3.2 PDL1/PD-1结合上调CD8~+T细胞中GATA1的表达 |
| 3.3 GATA1能够结合PLPP1的启动子区且受AKT/mTOR的调控 |
| 3.4 PDL1/PD-1通过AKT/mTOR增强CD8~+T细胞中GATA1的核转位,进而降低PLPP1表达 |
| 3.5 PDL1单抗治疗活化肿瘤微环境中抗原特异性T细胞中AKT/mTOR信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤微环境中T细胞耗竭与代谢重编程的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（6）ISET（微筛滤膜富集法）检测可手术乳腺癌循环肿瘤细胞的临床价值及可行性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.一般资料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.患者临床病理参数 |
| 2.循环肿瘤细胞的总体检测 |
| 3.不同分组下循环肿瘤细胞的检测 |
| 讨论 |
| 1.ISET(微筛滤膜富集法)检测循环肿瘤细胞的价值分析 |
| 2.本次研究中的结果分析 |
| 3.总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 循环肿瘤细胞在乳腺癌中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）GeneXpert MTB/RIF在系统性自身免疫病合并肺结核患者中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 观察组 |
| 1.2 对照组 |
| 2 实验仪器与试剂 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 标本采集 |
| 3.1.1 痰液样本采集 |
| 3.1.2 血样本采集 |
| 3.2 标本检测 |
| 3.2.1 GeneXpert MTB/RIF检测 |
| 3.2.2 MGIT960 液体培养及药敏试验 |
| 3.2.3 抗酸染色法 |
| 3.2.4 T-SPOT法 |
| 4 观察指标 |
| 5 质量控制方法 |
| 6 统计学方法 |
| 6.1 灵敏度 |
| 6.2 特异度 |
| 6.3 预测值 |
| 结果 |
| 1 GeneXpert MTB/RIF、MGIT960 液体培养、T-SPOT法和抗酸染色法在不同系统性自身免疫病中肺结核的检出率 |
| 2 GeneXpert MTB/RIF、MGIT960 液体培养、T-SPOT法和抗酸染色法检测结核分枝杆菌的效能分析 |
| 3 GeneXpert MTB/RIF在检测利福平耐药性方面的应用 |
| 4 GeneXpert MTB/RIF系统不同量级的结果与MGIT960 液体培养、T-SPOT法、抗酸染色法细菌计数各方法比较 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 系统性自身免疫病合并肺结核患者的诊断与耐药性分析研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 英文缩略词汇表及中文对照 |
| 致谢 |
（8）Treg、MDSC及PD-1阳性T细胞在头颈部鳞状细胞癌免疫抑制机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 背景 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 HNSCC体内环境中免疫抑制细胞分析 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 HNSCC体内免疫细胞因子的表达分析 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 HNSCC体内CD8+CTL细胞杀伤能力分析 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 HNSCC肿瘤局部抑制机制的分析 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 总讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 Insights into anti-programmed death (PD) immunotherapy in cancer |
| References |
（9）用于肝癌个体化治疗的三维药敏试验方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 三维培养系统的构建与评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 人原代肝癌细胞的三维药敏试验 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）ATP-TCA、常见耐药基因表达与Ⅰb2-Ⅱb期宫颈癌新辅助化疗近期疗效的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、梯度离心法在肿瘤药敏试验中的应用及临床相关性研究（论文参考文献）
- [1]口蹄疫灭活抗原稳定性及灭活疫苗效力检验替代方法的研究[D]. 杨生海. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究[D]. 孙琳. 吉林大学, 2021(01)
- [3]金葡菌噬菌体的筛选及对小鼠乳腺炎的抑制作用与机理研究[D]. 耿慧君. 大连理工大学, 2020(01)
- [4]糖基转移酶Fut8影响CD8+T细胞功能的机制研究[D]. 石晓娟. 郑州大学, 2020(02)
- [5]PD-1调控肿瘤微环境CD8+T细胞磷脂代谢重编程及功能的研究[D]. 平玉. 郑州大学, 2020(02)
- [6]ISET（微筛滤膜富集法）检测可手术乳腺癌循环肿瘤细胞的临床价值及可行性研究[D]. 曾涵凌. 南京医科大学, 2019(07)
- [7]GeneXpert MTB/RIF在系统性自身免疫病合并肺结核患者中的应用[D]. 刘婷. 青岛大学, 2019(03)
- [8]Treg、MDSC及PD-1阳性T细胞在头颈部鳞状细胞癌免疫抑制机制的研究[D]. 林树春. 福建医科大学, 2019(02)
- [9]用于肝癌个体化治疗的三维药敏试验方法研究[D]. 王杰钦. 南方医科大学, 2018(01)
- [10]ATP-TCA、常见耐药基因表达与Ⅰb2-Ⅱb期宫颈癌新辅助化疗近期疗效的相关性研究[D]. 宋丹. 首都医科大学, 2017(02)