一、人胚胎期表皮干细胞与汗腺发生过程关系的研究（论文文献综述）
倪娜[1]（2020）在《毛囊上段自体移植修复皮肤创面动物模型的构建和机制初探》文中研究说明研究背景自体皮移植是临床治疗烧伤、大面积皮肤撕脱伤等皮肤创伤最有效的方法。目前临床趋向采用微粒皮移植,最大限度地利用表皮干细胞在创面扩增以修复创面,尽管如此,自体皮源不足的问题仍严重影响大面积皮肤创面的治疗,是再生医学急需解决的瓶颈问题。近年来,随着对皮肤附属器研究的深入,研究者发现毛囊才是皮肤最大的干细胞库[1-3],提示位于毛囊上段的隆突部干细胞具有运用于创面修复的巨大临床应用前景[4]。临床实践已观察到含有毛囊的头皮皮片具有促进创面修复的作用。最初在临床烧伤科植皮创面观察到:含有毛囊的皮片移植治疗慢性创面的愈合速度比不含毛囊皮片移植更快[5];临床试验对比含有与不含毛囊的相同面积皮粒创面移植效果,发现含有毛囊者修复速度比阴性对照组快,第18周修复面积比约为2.27:1。相关研究发现,当皮肤或毛囊出现损伤时,毛囊干细胞也可以迁移到损伤部位,并通过增殖分化来修补组织缺损[6-8]。综上所述,我们提出以下假说:毛囊上段（毛囊隆突部干细胞所在部位）移植至皮肤创面,可以促进创面愈合。目的1.构建大鼠背部皮肤创面模型,观察拔除毛干的触须毛囊上段自体创面移植对创面愈合的影响。2.观察毛乳头细胞分泌蛋白SDF-1在不同周期人头皮毛囊中的表达模式;外源性SDF-1大鼠背部皮内注射诱导,观察其对局部皮肤毛囊数量、形态等的影响。方法1.顺着毛囊生长方向在大鼠一侧触须垫上剪取一楔形皮条,从皮条上分离出触须毛囊,制作拔除毛干的大鼠触须毛囊上段。2.制作大鼠背部皮肤创面模型。3.实验分组及创面处理方法:将大鼠随机分为三组,实验组将8-9个大鼠触须毛囊上段贴于自体背部皮肤创面;阳性对照组将制作创面所剪下的大鼠背部皮肤修剪成约0.3cm×0.3cm的皮片,将8-9个皮片贴于自体背部皮肤创面;空白组不进行任何移植处理。4.包扎固定创口:为大鼠戴上防咬颈圈,防止大鼠啃咬自体创口;将大鼠分笼饲养,防止互咬创口。5.术后第3、7、14、21天观察创面修复情况,取材,制备石蜡切片,行HE染色观察形态学变化,行荧光免疫组化观察表皮干细胞标记物CK15的表达情况。6.制备人头皮切片,确定切片中毛囊的生长周期,使用荧光免疫方法观察毛乳头细胞关键分泌蛋白SDF-1在人头皮毛囊中的表达。7.外源性SDF-1诱导大鼠背部皮肤毛囊形成动物模型的构建。（1）在SD大鼠背部正中后段皮肤以电动剃毛刀备皮,使用脱毛膏脱毛后,用标记笔画出1.5cm×1.5cm的正方形区域;（2）实验分组及创面处理方法:将大鼠随机分成三组,SDF-1注射组均连续皮内注射300μl外源性SDF-1（浓度500ng/ml）10天;PBS注射组均连续皮内注射300μl PBS 10天;空白组:不进行任何移植处理。（3）实验后处理与观察:将每只大鼠分笼饲养,每天观察大鼠的背部毛发变化。实验第12天,处死大鼠后,SDF-1注射组、PBS注射组和空白组分别在实验区取等量皮肤组织制备石蜡切片,行HE染色,镜下观察毛囊形态、大小、结构并计数,统计学分析。结果1.大鼠触须容易提取,形态结构清晰,肉眼可辨。2.将大鼠触须毛囊上段移植至自体背部创面,肉眼未见明显皮岛形成,第15天镜下可见移植的毛囊上段表面形成新的表皮细胞层,CK15阳性表达,可见毛囊干细胞迁移轨迹。3.在人头皮毛囊中,SDF-1表达部位主要表达于退行期毛乳头。4.分别使用SDF-1、PBS在脱毛处理后的SD大鼠背部皮肤进行皮内注射10天,SDF-1注射组、PBS注射组、空白组均长出毛发,实验组背部皮肤增厚较阳性对照组和空白组明显。SDF-1注射组毛囊个数、毛囊单位个数明显多于PBS注射组、空白组,差异具有统计学意义。PBS组与空白组间没有显着统计学差异。结论1.大鼠触须毛囊上段移植至自体背部创面可以形成新的表皮层,新生的表皮很可能是毛囊干细胞迁移、分化形成的。2.SDF-1可诱导大鼠背部毛囊形成。
李哲昊[2]（2020）在《毛囊干细胞与毛乳头细胞体外培养重建类毛囊器官》文中研究说明本文主要阐述毛囊的器官结构,同时给出提取毛乳头细胞（DS）以及毛囊干细胞（HFSC）的方法和鉴定标记物和鉴定方法,目的是在体外培养毛囊干细胞与毛乳头细胞,同时在体外培养两种细胞的类毛囊器官,为临床治疗脱发开辟新的治疗手段。当今社会,脱发朝年轻化、普遍化下发展,脱发问题除了对病人外观产生不利影响,还极大危及病人的生活质量与心理状态。毛发移植则为长效解决脱发问题唯一途径。毛发移植的根本就是将自体的资源进行人为的再次分配,然而,当前的毛发移植术所面临的最大问题就是无法找到可以提供大量毛发的供区。FUE是指自体供区直接提取单个毛囊单位移植物的技术,也就是说通过环钻切取供应毛囊的部分,与真皮中层,将毛囊单位和附近组织的连接切断,借助取出整个毛囊单位。此技术存在诸多优势,包括无需缝合、低创伤性、术后快速愈合等,对头皮张力较大或瘢痕体质病人尤其适用,然而此项技术也存在下述不足:①提取毛囊单位所需时间过长,只能应用在植发不大的患者中;②进行此项操作时,易导致毛囊受损,使得移植毛发存活率下降。毛发移植的根本就是将自体的资源进行人为的再次分配,但是所面临的最大问题就是无法找到可以提供大量毛发的供区。经研究发现,HFSC具备慢周期性,此细胞于体内通常呈静止态,进行体内培养时或受到内环境刺激,其可显示出超强的增殖活性。毛囊干细胞是一种能向多个组织分化的潜在组织,其能分化的组织包括表皮、毛囊、各种腺体等,并且在机体遭遇到创伤后的愈合机理中再次生成的毛囊可对直接抑制瘢痕增生。毛乳头细胞在体外也可分化为毛乳头型的细胞群,使毛囊干细胞的繁殖生长提供适合的条件,毛囊干细胞的多种分化潜能促使两种细胞具备生出毛发的功能,应用来自同一个种属的毛囊干细胞和毛乳头细胞解决抗性问题并为未来的毛发移植提供一种新的选择。所以,体外培育毛囊干细胞也是一种增加毛囊细胞的方式,能够获得足够的自体毛囊单位,这样的培养方法在理论上来说能够彻底解决毛囊供区不足的问题。同时,在高速发展的组织工程以及克隆技术推动下,有希望可成功筛选与克隆毛发干细胞,为此类细胞的培养分化与扩增技术奠定了基础。本文通过研究和总结国内外各种试验培育筛选毛囊干细胞以及毛乳头细胞的方法,找寻出最合适的提取和筛选毛囊干细胞和毛乳头细胞的方法,并进行体外培育扩增,通过两者混合制造出细胞悬液并进行动物实验,通过将混合物悬液注射入裸鼠背部,并观察生长出的毛发,之后对毛发进行染色切片以观察重建的类毛囊器官结构,并观察重建后的类毛囊器官的功能。
陈润开[3]（2020）在《基于工程化汗腺类器官实现创面功能性修复的初步研究》文中研究表明目的（1）探究肾上腺素受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）信号通路提高表皮角质细胞干性潜能（2）实现人表皮角质细胞谱系重编程为汗腺样细胞（3）探究汗腺类器官的体外构建与维持方法（4）建立裸鼠烫伤模型进行体内移植实验,验证汗腺类器官促进汗腺再生以及加速皮肤创面愈合的作用方法（1）选用人表皮角质细胞（human epidermal keratinocyte,HEK）和人永生化表皮细胞（human immortalized keratinocyte,Ha Ca T）系进行体外细胞实验。使用异丙肾上腺素（isoproterenol）在体外激活β2-AR信号通路,通过高通量测序筛选出HEK细胞干性相关基因并进行转录组学分析。进一步的,使用isoproterenol和β2-AR选择性抑制剂ICI-118,551在体外激活或抑制β2-AR的表达水平,通过蛋白免疫印迹法（Western blot）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）等方法分别从蛋白和RNA水平验证已筛选出的重点基因在HEK、Ha Ca T细胞中的表达,验证β2-AR信号通路提高HEK、Ha Ca T细胞干性的作用。（2）构建过表达EDA基因质粒,通过慢病毒转染方式获得过表达EDA基因HEK细胞系,并命名为HEK-E;再设计含人外胚层发育不良（ectodysplasin,EDA）基因的启动子序列,借助CRISPR/d Cas9技术,获得内源性上调EDA基因的Ha Ca T细胞系,并命名为Ha Ca T-E;RT-PCR、Western blot免疫荧光染色检测鉴定汗腺细胞标记物的表达,透射电镜观察细胞超微结构。（3）将HEK-E和Ha Ca T-E细胞种植于基质胶（Matrigel）中使用汗腺专用培养基诱导,进行体外三维环境培养,待细胞增殖发育形成圆形囊状结构（cluster）后进行固定,免疫荧光染色鉴定汗腺细胞标记物。将cluster移植至微型流体控制系统（微流控芯片）中在具有小分子浓度梯度的汗腺专用培养基中诱导培养后进行固定,免疫荧光染色鉴定汗腺细胞标记物。（4）建立BALB/c Nude小鼠脚掌烫伤模型,分别给予汗腺培养基（Sw G-specific medium,m Sw G-M）、汗腺样细胞（induced Sw G cells,i Sw G）以及汗腺类器官（i Sw G-derived spheroids,i Sw GO）注射移植。对移植后第3、7、14天残余创面面积进行测量计算并绘制创面愈合曲线图。移植试验3周后进行碘-淀粉发汗试验检测发汗情况。对发汗试验阳性的鼠掌进行组织HE染色和免疫荧光染色,观察汗腺再生情况。结果（1）对RNA-seq结果进行转录组学分析发现,经isoproterenol激动后HEK细胞干性基因上调明显,并且能够促进HEK细胞向腺体发育分化。进一步的,HEK、Ha Ca T细胞重点干性基因SOX9、OCT4、LGR5、LGR6经过RT-PCR和Western blot双重验证在显示相较于对照组上调明显,且isoproterenol作用可被β2-AR选择性抑制剂ICI-118,551抑制。结果表明,β2-AR激动剂isoproterenol具有提高HEK、Ha Ca T细胞干性潜能的作用。（2）慢病毒包装EDA质粒后转染HEK细胞,筛选后获得HEK-E细胞GFP表达阳性。经过RT-PCR和Western blot的验证证实EDA表达明显升高;慢病毒分别包装sg RNA质粒和d Cas9质粒依次转染Ha Ca T细胞,筛选获得的阳性细胞Ha Ca T-E表达绿色荧光蛋白（GFP）且具有G418抗性;经过汗腺培养基诱导后CK18、CK19、α-SMA等汗腺标记物表达阳性。透射电镜可见微绒毛结构。结果表明HEK和Ha Ca T成功重编程汗腺为样细胞。（3）HEK-E和Ha Ca T-E细胞在含有汗腺培养基的基质胶中诱导后发育形成汗腺类器官,免疫荧光染色显示CK18、CK19、α-SMA、APQ5、NA-K-ATPase表达阳性。将汗腺类器官移植到微流控芯片中继续培养,其形态由圆形囊状结构发育为具有长轴的管腔结构,免疫荧光染色显示CK19、α-SMA表达阳性。结果表明经过基质胶三维培养后已形成具有水盐代谢功能的汗腺类器官,再通过微流控提供的具有小分子梯度的培养基中被定向诱导成了更加接近原生汗腺的汗腺样结构。（4）裸鼠烫伤模型证实i Sw GO相较于m Sw G-M和i Sw G能够加速脚掌烫伤创面愈合。移植试验3周后进行碘-淀粉发汗试验显示i Sw GO组出现阳性表现。而另外两组无阳性表现。对三组鼠掌进行HE染色,结构显示i Sw GO组出现汗腺样结构,进一步的组织免疫荧光染色显示汗腺样组织GFP阳性,同时表达CK18和α-SMA。结论本研究对isoproterenol影响表皮角质细胞干性潜能进行了初步探索,发现isoproterenol具有提升表皮角质细胞干性的作用。以此为基础利用表皮角质细胞重编程为汗腺样细胞降低了跨谱系难度,提高了重编程效率。此外,我们利用重编程来源的汗腺样细胞进行体外汗腺类器官培养,并借助微流控芯片定向诱导实现了汗腺再生。为今后汗腺再生的研究与治疗提供了新的思路。
朱美抒[4]（2020）在《PRP对毛囊干细胞和毛囊生长的影响及机制》文中指出[目的和意义]雄激素性脱发（Androgenic Alopecia,简称AGA）是最常见的脱发病因之一,也是世界上最常见的皮肤疾病之一,目前临床治疗AGA的方法非常局限。近年来,已有富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma,简称PRP）用于治疗AGA的文献报道,但是疗效不一,相关机制也知之甚少。本研究的目的是探讨PRP对于AGA治疗效果及其细胞和分子机制,以期为临床应用提供理论和方法学依据。[内容和方法]1、采用雄性C57/BL小鼠（7周）作为研究对象,将PRP分别以传统的钙离子激活后血小板裂解液（PC）、超声激活后血小板裂解液（PS）和超声激活后离心上清液（PSS）分组注射在小鼠背部,初步研究不同处理方式的PRP对毛囊的作用;2、以K14-H2B-GFP转基因小鼠为研究对象,皮内分别注射PSS和生理盐水（NS）进行对比,观察PSS对毛囊干细胞的作用;3、以人永生化角质形成细胞（Immortal Keratinocytes,简称HaCaT细胞）和小鼠真皮来源干细胞群（Skin-derived Precursors,简称SKPs）为研究对象,分别与PSS和PC共培养,观察PSS和PC对这两种毛囊周期循环相关细胞的生物学作用;4、动物体内毛囊重组实验:提取新生的K14-H2B-GFP转基因小鼠的表皮干细胞和SKPs细胞,混合后分别添加PSS和NS,移植在裸鼠背部对称的创口上,对比观察PSS对毛囊重组的影响;5、应用蛋白芯片技术,检测不同方法激活PRP的生长因子水平。[结果]1、与钙离子激活PRP相比,超声激活PRP（PS）和超声激活后离心上清液（PSS）具有更强的促进毛囊从休止期进入到生长期的作用;2、超声激活PRP离心上清液（PSS）具有激活毛囊干细胞的作用,从而促进毛囊提前由休止期进入到生长期;3、PC组和PSS组明显促进角质细胞的增殖,PSS可以促进SKPs的存活;4、超声激活PRP离心上清液（PSS）具有促进毛囊重组,从而促进毛发再生和生长的作用;5、检测的41种生长因子中,超声激活PRP离心上清液（PSS）显示有16种生长因子的含量比钙离子激活PRP高（≥2倍）,这些生长因子大多具有促进毛囊再生作用。[结论]超声激活PRP具有更好的激活毛囊干细胞和促进毛囊再生的作用。
赵倩[5]（2017）在《人成纤维细胞转化为DP样细胞并参与毛囊重建》文中进行了进一步梳理由于现代社会工作压力增大,饮食睡眠不规律,外加环境污染等原因,脱发已经成为一个社会性的普遍问题。最新临床研究表明,在最常见的雄激素脱发患者中,头皮毛囊干细胞并未受到损害,而是由于真皮乳头（dermal papilla,DP）的信号传导受到干扰,从而无法长期维持头发的生长。因此DP在脱发中是关键的药物治疗靶点。目前治疗脱发的另一种重要手段是毛发移植,但用于移植的毛囊不能进行扩增,因而在数量上受到限制。近年来,随着表皮干细胞与毛囊干细胞研究的不断深入,以干细胞为基础的毛囊重建为治疗脱发带来了新的希望。然而,毛囊重建不仅需要具有能够分化成毛囊上皮结构的表皮谱系干细胞,还需要具有毛囊诱导能力的DP真皮细胞。但DP细胞无法在体外大量扩增并维持其诱导能力。因此大多数研究致力于在体外扩增DP细胞并维持其毛囊诱导能力的特性的研究,但效果远达不到临床需求。因此,如何在体外获得大量具有毛囊诱导能力的真皮细胞进行移植并重建毛囊是目前该领域急需解决的问题。DP是一群特化的真皮成纤维细胞,在毛囊形态发生以及毛囊周期调控中发挥重要作用。研究表明成纤维细胞与具有毛囊诱导能力的DP细胞具有共同起源,即两者均来源于小鼠胚胎发育12.5天的成纤维前体细胞,且两者基因表达的相似性高达96%。依据DP与成纤维细胞发育起源的微妙关系,我们尝试建立了因子诱导体系以及共培养诱导体系,将大量易获得的人真皮成纤维细胞转化为具有毛囊诱导能力的DP细胞,实现毛囊再生,为毛囊重建治疗脱发提供潜在细胞来源。在本研究中,首先通过检测人DP细胞中高表达的特征性基因,建立了检测诱导转化体系的初步评判标准;其次,建立了将人胎儿与成年包皮来源的成纤维细胞转化为毛囊诱导能力细胞的多因子诱导体系即通过加入特定浓度生长因子（PDGF+FGF2）与小分子化合物BIO,诱导培养六天,随后加因子三维悬浮培养24小时。研究结果表明诱导之后胎儿和成人成纤维细胞高表达大部分DP的特征性基因,我们称之为DP样细胞。将胎儿与成人DP样细胞与新生小鼠表皮细胞相混合移植到免疫缺陷小鼠的背部,可观察到毛囊结构的形成,并且发现DP样细胞参与形成毛囊的DP以及真皮鞘结构的组建。值得关注的是,成人包皮来源的成纤维细胞经因子诱导体系的转化也能促进毛囊重建过程中毛囊的形成,这一实验结果对临床毛囊重建具有重要的参考价值。此外,我们还探究了毛囊重建过程中,大鼠毛囊干细胞以及成年包皮来源的角质细胞在毛囊重建过程中的作用。本研究建立了将易大量获得的人成纤维细胞转化为具有毛囊诱导能力的DP样细胞的转化模型,该模型将在组织工程——毛囊重建与临床脱发治疗领域具有重要应用价值。同时,还将为揭示皮肤发育过程中的上皮-间充质的相互作用机制提供重要线索。
刘煜凡[6]（2017）在《基于3D生物打印技术的微结构对组织工程表皮中干细胞行为的影响》文中研究指明背景:皮肤是机体最大的器官,因烧、创伤导致的皮肤大面积损伤会造成机体局部畸形、皮肤功能失调,内环境稳态失衡甚至危及生命。因此,针对创伤后皮肤的修复再生是临床上亟待解决的问题。基于组织工程技术制成的皮肤替代物一度成为有效的修复途径,但这种皮肤替代物缺少汗腺、皮脂腺、毛囊等皮肤附属器,无法恢复正常皮肤的生理功能。目前,针对皮脂腺、毛囊的再生研究已相对成熟,但针对汗腺再生的研究进展缓慢,有功能的再生汗腺有助于提高机体对外环境的适应能力和恢复排汗功能。表皮干细胞作为皮肤发育的祖细胞,在分化为皮肤和皮肤附属器时有显着的优势,是汗腺再生研究中首选的干细胞类型。本团队在前期已证实3D微结构可诱导表皮干细胞分化为汗腺细胞,但不同构架的3D微结构在诱导效应上有差别,这为后续基于3D生物打印技术的汗腺再生研究在结构选择上造成了的困难。因此探索不同构架的3D微结构对表皮干细胞行为的影响并建立稳定且具良好诱导效应的3D微结构是后续研究的重要基础。目的:基于3D生物打印技术探索不同构架的微结构对表皮干细胞行为学变化的影响并建立稳定且具良好诱导效应的3D微结构,为创伤后皮肤的修复与再生提供理论基础。方法:1、表皮干细胞的提取:胚胎期12.5天的GFP-C57BL/6小鼠,剪取其背部皮肤后,采用已成熟的表皮干细胞培养方法进行培养。2、足趾部真皮基质匀浆:选择出生后0.5天的野生型C57BL/6小鼠,剪取其足趾部研磨成真皮基质匀浆（PD）。3、3D生物打印:选择3种不同直径的打印喷头（210μm、340μm和420μm）构建微结构。4、表皮干细胞行为学检测:荧光显微镜和活/死细胞染色技术用于展示3D微结构中表皮干细胞的增殖能力和细胞活性,免疫荧光染色技术用于检测3D微结构中表皮干细胞分化为汗腺细胞的能力。5、统计学分析:采用方差分析和样本t检验等方法进行统计学分析。结果:1、三种不同构架的3D微结构均可促进小鼠表皮干细胞的有效增殖。2、在各个观察时间点上,210μm组3D微结构中的表皮干细胞活性最低,420μm组的细胞活性最高,细胞活性与剪切应力呈反比。3、三种不同构架的3D微结构均可诱导小鼠表皮干细胞分化为汗腺细胞。4、340μm组3D微结构中表皮干细胞可聚集形成类腺样球形结构。结论:本次研究构建的340μm组3D微结构具有最佳的诱导效应。这为后续基于3D生物打印技术的汗腺再生研究以及进一步构建具有生物相容性的组织工程表皮模型奠定了基础。
谢江帆[7]（2016）在《基于RNA-seq筛选关键转录因子诱导表皮干细胞定向分化为汗腺细胞的研究》文中指出目的:（1）建立小鼠汗腺全发育模型,从组织形态、细胞水平和分子水平考察汗腺从胚胎期到成熟期的整个发育过程,由此确定在表皮干细胞分化为汗腺细胞发育过程中具有关键意义的两个时间点。（2）进一步验证上述两个关键时间点所获取细胞在生物学特征上的差异性,并确定胚胎期（E12.5）小鼠足部表皮干细胞与其他部位表皮干细胞的一致性。（3）在上述研究的基础上,筛选并鉴定小鼠表皮干细胞向汗腺细胞特化和定向分化过程中所涉及的关键转录因子。（4）深入探讨上述关键转录因子在表皮干细胞向汗腺细胞特化及定向分化过程中的细胞分子机制,从而为探索新的汗腺修复及再生途径提供策略。方法:（1）选取同一种属但不同时期（E12.5、E17.5、P0.5、P5和P28）小鼠足部皮肤,通过分离培养不同时期小鼠汗腺原代细胞,观察其形态学变化;采用免疫荧光和RT-PCR法检测其角蛋白表达特征。（2）选取E12.5和P5小鼠足部皮肤,通过分离培养不同时期小鼠原代表皮干细胞和汗腺细胞,观察其形态学差异;凭借组织切片HE染色法,观察不同时间点皮肤组织的结构;利用免疫荧光的方法检测其角蛋白表达差异。选取E12.5d小鼠足部皮肤和背部皮肤,采用组织切片HE染色法,观察相同时间点（E12.5）小鼠足部皮肤和背部皮肤组织的结构,利用免疫荧光的方法检测其角蛋白表达特征。（3）选取同一来源的E12.5和P5小鼠足部汗腺细胞,通过Trizon法提取Total RNA和Hi Seq2500进行转录组测序寻找差异表达基因,通过生物信息学分析选定关键转录因子,并利用RT-PCR和Western blot法分别做分子生物学验证。（4）构建关键转录因子（Fox-c1和Irf-6）相关慢病毒载体在Polybrene辅助下进行小鼠表皮干细胞的感染,分为四组,control组、只转染Fox-c1组、只转染Irf-6组和共同转染Fox-c1和Irf-6（F+I）组。选取转染后0d和14d两个时间点,观察转染后细胞形态学变化;根据汗腺细胞与表皮干细胞贴壁能力的显着差异检测转染后细胞转化效率;利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;通过细胞免疫荧光和Q-PCR法分别检测转染后不同组细胞角质蛋白在蛋白质和m RNA水平的表达。构建小鼠足趾部深II度烧伤模型,将转染5d后的细胞注入烧伤部位,11d后进行检测。通过组织切片HE染色法观察汗腺细胞在体内再生的形态学情况;利用免疫荧光法检测不同转染组注入小鼠足部烧伤部位后汗腺细胞角质蛋白的表达;最后利用碘-淀粉试验检测汗腺功能。结果:（1）P0.5到P28汗腺卷曲成团并出现导管部和分泌部。细胞免疫荧光检测结果显示,汗腺细胞在整个发育过程中K8和K19呈阳性表达,且在出生后各时间点表达增强;E12.5和E17.5时K14表达较强,其余时间点均较弱;出生前K10表达呈阴性,但出生后有逐渐增强的趋势。RT-PCR结果显示与细胞免疫荧光结果基本相符,组织切片免疫荧光结果显示,汗腺分泌部多见K8和K19高表达细胞;汗腺导管部则多见K10高表达细胞;K14高表达细胞则出现在出生前或出生后包绕汗腺的肌上皮处。（2）细胞形态学结果显示E12.5小鼠足部表皮干细胞为长梭形,而P5小鼠足部汗腺细胞卷曲成团,有汗腺导管部出现;HE染色结果显示在E12.5小鼠足部皮肤组织无汗腺结构,而P5小鼠足部皮肤组织可见明显汗腺结构;细胞免疫荧光结果显示,表皮干细胞K5和K14的表达相对较高,而汗腺细胞K8和K18的表达相对较强。HE染色结果显示在E12.5小鼠足部皮肤和背部皮肤组织结构相同,且免疫荧光结构显示两者的角质蛋白（K5/K14）表达一致。（3）生物信息学分析筛选出小鼠表皮干细胞向汗腺细胞特化和定向分化的关键转录因子为Fox-c1和Irf-6,RT-PCR和Western blot结果均显示汗腺细胞Fox-c1和Irf-6的表达均明显高于表皮干细胞的表达。（4）CCK-8检测结果显示转染后的细胞增殖能力发生明显变化;细胞形态学结果显示转染后14d的表皮干细胞呈现出类汗腺细胞的形态;细胞免疫荧光和Q-PCR结果显示,相比较于control组,转染组细胞K5/K14和K8/K18的表达均明显增高。将转染后细胞分别注射到烫伤的小鼠足部表皮,14d组织切片HE结果显示,control组和Irf-6组未见汗腺样结构,Fox-c1组和F+I组可见汗腺样结构;组织切片免疫荧光结果显示与体外细胞免疫荧光结果显示相同;碘-淀粉试验显示control组和Irf-6组阴性,而Fox-c1组和F+I组碘-淀粉试验阳性。结论:（1）建立了小鼠汗腺全发育模型,从组织形态、细胞水平和分子水平考察汗腺从胚胎期到成熟期的整个发育过程,并由此确定了在表皮干细胞分化为汗腺细胞发育过程中具有关键意义的两个时间点,即E12.5和P5。（2）进一步验证上述两个关键时间点（E12.5和P5）所获取细胞在生物学特征上的差异性,并确定胚胎期（E12.5）小鼠足部表皮干细胞与其他部位表皮干细胞的一致性。（3）在上述研究的基础上,筛选并鉴定小鼠表皮干细胞向汗腺细胞特化和定向分化过程中所涉及的关键转录因子为Fox-c1和Irf-6。（4）深入探讨上述关键转录因子（Fox-c1和Irf-6）在表皮干细胞向汗腺细胞特化及定向分化过程中的细胞分子机制,从而为探索新的汗腺修复及再生途径提供策略。
李元朝[8]（2008）在《Wnt-1的生物信息学分析及其对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究》文中进行了进一步梳理表皮干细胞是皮肤组织特异性干细胞,位于表皮基底层,在维持表皮更新,保持细胞恒定等方面起着重要作用,它也是皮肤及其附属器官发生、修复、改建的关键性源泉。表皮干细胞的增殖与分化不仅为自身基因所预先设置,还受到干细胞“壁龛”（Niche）的调控。Wnt家族是干细胞“壁龛”中重要的组成部分,参与细胞分化、细胞极性、细胞迁移以及细胞增殖等过程。其中,Wnt-1在神经上皮的发育、乳腺癌的发生等上皮性组织的发育与分化的过程中扮演着重要的角色。Wnt-1的表达与皮肤及其附属器的发育在时相上一致:Wnt-1在胚胎时期表达活跃,而成年时多处于相对静止状态;人表皮干细胞于胎龄24周时形成成熟的腺体,而在成年人的创口愈合处,则不能再生为任何腺体,提示表皮及其附属腺体的发育与Wnt-1的表达有很大的关系。基于此,我们在本课题里进行了Wnt-1影响人表皮干细胞分化与增殖的相关研究。在本课题中,我们基于“结构决定功能”的思想,首先以生物信息学的手段和方法,对Wnt-1进行氨基酸序列分析、二级结构预测和理化性质分析,以期获得对Wnt-1的分子水平的了解。在研究Wnt-1对人表皮干细胞的分化与增殖的影响时,我们借助了重组腺病毒基因导入技术将Wnt-1导入到人表皮干细胞内。这是因为Wnt-1是一种不稳定蛋白,在生理条件下极易降解,添加外源性Wnt-1蛋白至细胞培养基中,难以维持其浓度的稳定,且会增加组间误差和组内误差。在人表皮干细胞内表达Wnt-1蛋白前后,我们检测了其增殖能力、标记性分子、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-7浓度、细胞内Ca2+浓度等多项指标,以研究Wnt-1对人表皮干细胞分化与增殖的影响。第一部分Wnt-1的生物信息学分析一、目的:全面分析Wnt-1蛋白的生物信息学特征二、方法:首先,从NCBI上摘录Wnt家族的全部氨基酸序列,以Phylip和Treeview软件绘制该家族的系统进化树;然后,以ExPASY网站提供的生物信息学分析模块和本地Anthprot生物信息学分析软件对Wnt-1的氨基酸组成成分、等电点、信号肽切割位点、滴定曲线等进行分析;以GOR4、HNN、SOPMA三种方法预测Wnt-1的二级结构;以ExPASY网站相关模块分析Wnt-1的亲水性、极性以及折返系数;最后对这些结果进行比对和分析。三、结果:Wnt家族中,Wnt-4、Wnt-11和Wnt-16单独存在,其他的成员均成对存在;Wnt-1与Wnt-6配对,二者亲缘关系最近。Wnt-1整体略带正电荷;不稳定指数为62.61,为一种不稳定蛋白;整体亲水性指数为-0.347,为一种疏水性蛋白;等电点约在9.0附近;信号肽为一条含27个氨基酸的短肽。GOR4、HNN、SOPMA三种二级结构预测方法均认为Wnt-1的第25～50、112～172、222～238、272～360位区域主要由不规则卷曲结构和伸展结构所构成。亲水性、极性以及折返系数分析结果均提示:第59～69、89～102、150～160、175195、209～220、335342位区域的量化指标高于阈值。四、结论:Wnt-1与Wnt-6配对存在;Wnt-1在生理条件下不稳定;Wnt-1蛋白第150～160和335342两个区域既符合功能结构域的空间构成要素,又符合理化构成要素,最有可能成为其功能结构域。第二部分Wnt-1重组腺病毒的构建一、目的:构建Wnt-1重组腺病毒颗粒二、方法:从其他研究者取得已经构建好的,经测序证实序列无误的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/Wnt-1,将其线性化后在BJ5183细菌中和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组,构建成重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Wnt-1;使用脂质体转染试剂盒将重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Wnt-1导入QBI-293A细胞中,借助该细胞中提供的反式补偿,产生具有普遍感染能力的pAdEasy-1/ Wnt-1重组腺病毒颗粒。最后,对这些病毒颗粒进行大量扩增,以满足下一步实验之用。三、结果:重组腺病毒质粒pAdEasy-1/Wnt-1构建完成后,以Pac I酶切后,可见一条远大于15Kb的明亮条带和一条约4.5Kb的条带,与理论值完全吻合,证明重组质粒构建成功;以该质粒转染QBI-293A细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达,证明产生了携带Wnt-1重组穿梭质粒的腺病毒颗粒;经大量扩增,最终获得足够的pAdEasy-1/Wnt-1重组腺病毒颗粒。四、结论:Wnt-1重组腺病毒颗粒构建成功。第三部分Wnt-1对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究一、目的:研究Wnt-1对人表皮干细胞分化与增殖的影响二、方法:首先,以IV型胶原快速粘贴法获得人表皮干细胞,并借助重组腺病毒技术将Wnt-1基因导入人表皮干细胞;随后观察绿色荧光蛋白的表达,并以RT-PCR法检测Wnt-1 mRNA在人表皮干细胞中的存在;最后以CASYexcell系统检测人表皮干细胞的增殖能力,以免疫组化法检测角蛋白K5、K6、K7、K8、K10、K18、K19以及CD44、CEA、ER、PR等标记性分子的表达,以ELISA法检测细胞培养基中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-7的浓度,以激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+浓度。三、结果:分离获取的人表皮干细胞在接种后第4天进入快速生长期,第8天时到达平台期;Wnt-1基因导入人表皮干细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR也检测到了Wnt-1mRNA的存在,故以双重标准证明了Wnt-1基因在人表皮干细胞中的存在与表达;CASYexcell系统检测后发现,人表皮干细胞直径无明显变化,而细胞增殖则明显加强;人表皮干细胞角蛋白K10的表达由阴性变为阳性,K18的表达增强,K19的阳性表达减弱,说明其已经发生了部分转化;培养基中的MMP-2、MMP-7的浓度均显着增高,说明人表皮干细胞获得了降解细胞外基质的分子基础;人表皮干细胞内Ca2+浓度明显升高,使其获得脱离干细胞“壁龛”的趋势。四、结论:Wnt-1具有诱使人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的趋势。
韩兵[9]（2007）在《汗腺发育相关基因及其联用骨髓间充质干细胞促进汗腺再生修复的研究》文中进行了进一步梳理目的：1．研究胎儿不同发育阶段皮肤组织的形态结构及抗原表达，并检测汗腺发育中皮肤组织内某些基因转录表达水平的动态变化，探讨皮肤附属器汗腺的发生和发育规律，进而寻找在汗腺发育中起重要作用的相关基因；2．研究汗腺相关基因与骨髓间充质干细胞的应用对汗腺再生修复的影响，探讨基因和干细胞治疗在汗腺组织再生修复方面的可行性。方法：1．采用HE染色和免疫组化方法观察胎龄为10～36w人胎儿皮肤组织的结构和特征，采用RT-PCR和western blotting等方法分析人类胎儿皮肤及汗腺附属器生理发育过程中的相关基因表达及其规律。2．从人胎儿成纤维细胞中克隆人汗腺相关基因的DNA片段，构建真核表达质粒，采用裸基因注射和体外转染大鼠MSCs后局部移植的方式处理裸鼠烫伤部位，RT-PCR和western blotting检测MSCs导入基因表达水平的变化，采用常规和免疫组化染色观察汗腺组织再生修复情况，结合碘-淀粉发汗试验检测汗腺功能以判定治疗效果。结果：1．不同发育阶段胎儿皮肤组织结构呈现规律性的演进，光镜下观察汗腺组织的发生发育过程大致分为三个阶段：胎儿发育第12～16w，为汗腺发育启动期，胎儿表皮基底层细胞分裂增殖，出现局灶增殖相间分布细胞团，进而向真皮凹陷生长形成表皮嵴；表皮嵴基底部及部分区域的基底层细胞增生活跃，相互聚集形成皮肤附件包括汗腺的原基，发育至16w左右的胎儿皮肤可观察到汗腺原基部细胞呈条索状向真皮深层生长。胎儿发育17w至24w，为汗腺发育成形期，汗腺发生发育活动在此期到达高峰，皮肤基底层细胞不断发生新汗腺原基的活动在此期到达高峰；汗腺原基细胞条索继续向真皮深部延伸生长，末端膨大形成蟠管，连接蟠管和原基的中段形成皮内导管原基；20w时细胞条索内部部分细胞退化变性形成腔隙，之后腔隙彼此沟通形成贯通管腔；23～24w，表皮基底层细胞形成汗腺原基活动减弱，汗腺数量趋于稳定，组织结构初步形成。胎儿发育25～33w，为汗腺发育成熟期，汗腺数量稳定，结构进一步完善。2．免疫组化结果显示汗腺的形成过程中表型变化的特殊规律：β1整合素在汗腺原基细胞表达阴性，汗腺蟠管形成后在蟠管细胞表达阳性；CK7在汗腺结构发生早期不表达，汗腺发育形成细胞索后在分泌部和皮内导管部原基细胞表达且表达部位呈现规律性下移；CK14在皮肤基底层和汗腺导管部连续表达；CK8／18在形成分泌部后表达；CK19和CEA在汗腺形成早期就有强表达并持续至汗腺成熟后。3．RT-PCR和western blotting检测结果显示皮肤中FGF10和EDA的转录表达在汗腺发育三阶段呈现规律性的上升-平台-下降趋势，与汗腺发生发育的变化规律基本相符；FGF7无上述显着性的变化。4．从胎儿成纤维细胞获取FGF10和EDA-A1基因片段，构建真核表达质粒，经酶切图谱鉴定和测序证实构建成功；将真核质粒注射到烫伤裸鼠足掌，可以促进汗腺的再生，发汗试验强阳性。5．采用构建的质粒以脂质体为载体体外转染大鼠MSCs，免疫细胞化学染色和western blotting检测结果显示目的基因表达显着增强，并分泌相应蛋白。将BrdU标记后的基因转染MSCs局部移植到裸鼠烫伤部位，显示部分移植的MSCs能够参与汗腺组织结构的再生修复并表达汗腺细胞表型。结论：1．皮肤汗腺的发育形成有明显的阶段性规律，其发育相关基因的转录表达水平的变化与之基本相符。2．局部直接导入汗腺发育相关基因对汗腺损伤后再生修复有促进作用，而基因修饰的骨髓间充质干细胞亦可有效参与汗腺修复，基因治疗联合干细胞治疗技术将为烧伤患者皮肤功能重建乃至完全再生带来新的希望。
刘洋[10]（2006）在《机械应力对表皮干细胞增殖、分化影响的研究》文中指出人体细胞生长在机体提供的微动力学环境中,机械应力不仅能引起细胞形态、结构变化,还能调控细胞的功能状态,影响细胞的增殖、分化及凋亡,在某些生理和病理过程中起着重要作用。业已证明,适当的机械应力可促进细胞增殖与分化,通过外力刺激因素获得“额外”组织的临床技术均是基于这一理论,并已在临床上收到了令人满意的疗效。如骨科的肢体牵引延长术、骨折的加压固定术、颅颌面外科的颅颌骨牵引术以及整形外科的皮肤软组织扩张术（skin soft-tissue expansion,SSTE）等。同时研究表明,不同种类的细胞有明显的异质性,对相同的应力刺激所表现出的效应不同,而同一细胞对不同的应力响应也不同,因此,其他研究领域的结果难于指导某一领域的临床实践。目前开展的相关基础研究比较活跃的领域主要集中在骨细胞（研究应力成骨）、血管平滑肌细胞（研究高血压）、血管内皮细胞、肾小球系膜细胞（研究肾小球性高血压）、以及肺上皮细胞等,而与SSTE相关的研究文献报道甚少。更未见应力与表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）相关性的文献。自1976年Radovan发明可控式扩张器以来,SSTE已广泛应用于临床,数以万计的患者从中受益,现已成为整形外科的常规治疗手段之一。虽然SSTE经过了30年的发展,在实验研究、临床应用、扩张方法、并发症防治等诸多方面取得了长足的进展,然而,其扩张周期较长、并发症较多的缺憾仍尚未从更本上获得解决。因此,如何缩短扩张时间、减少并发症即成为SSTE研究领域的焦点问题。业已证明,扩张产生的“额外”皮肤来源于皮肤的机械蠕变、弹性扩张和生物性增殖,其中尽快获得生物性增殖、充分有效的刺激细胞的有丝分裂活动而获得所需要的“额外”皮肤量,可能是克服上述难题的根本所在,但迄今为止,皮肤细胞在扩张过程中的增殖分化行为尚不甚清楚。ESC作为皮肤组织的特异性干细胞,不仅是维持皮肤日常新陈代谢的主要功能细胞,而且与创面的修复亦紧密相关。但目前就有关ESC在SSTE过程中所起到的具体作用,或与皮肤扩张间的关系尚鲜为人知。为此,深入认识SSTE过程中ESC的分布、增殖与分化特征以及相关的调控机制,无疑对充实、完善SSTE基础理论以及对指导临床更加完美地应用SSTE有着极其重要的意义。为此,本研究拟以离体与在体两种手段开展以下实验观察:利用表皮干细胞及其增殖、分化过程中不同的细胞表面标志物以及增殖细胞核抗原（PCNA）标记增殖期细胞的特点,采用免疫组织化学法观察扩张过程中具有增殖能力的表皮干细胞、短暂扩充细胞的分布与数量差异,初步观察皮肤扩张术对表皮干细胞增殖分化的影响,可进一步研究表皮干细胞在皮肤扩张中的作用。此外,用机械应力作用于体外培养的细胞,研究其受应力作用后的各种变化,是目前细胞生物学领域发展十分迅速的一种方法。通过分离培养人表皮干细胞,建立可行的压应力细胞培养体系装置,观察和研究压应力对表皮干细胞增殖分化的影响。【目的】观察大鼠活体皮肤软组织扩张术对其扩张表皮细胞增殖分化特征的影响以及间歇压应力对离体表皮干细胞增殖分化特征的影响并探讨其可能的作用机制。【方法】1) 36只Wistar大鼠制作皮肤扩张动物模型,并随机分为扩张组和非扩张对照组。利用表皮干细胞表达角蛋白（keratin 19,K19）、p63,短暂扩充细胞表达K14及增殖细胞核抗原（PCNA）的特点,分别于扩张过程中与扩张后的不同时相点,采用链霉卵白素-生物素（SP）免疫组织化学染色法检测扩张皮肤表皮干细胞和短暂扩充细胞的分布特征,及常规HE染色观察扩张皮肤表皮的厚度改变。2)通过我们已建立的鼠表皮干细胞体外分离、培养的方法,进行人表皮干细胞的体外分离、培养,并利用链霉卵白素-生物素（SP）免疫组织化学染色法和细胞周期分析进行鉴定;采用培养细胞加压装置施以不同压应力（4kPa,6kPa,8kPa,10kPa,12kPa）对表皮干细胞加压,利用表皮干细胞特异性表达角蛋白19及终末分化细胞表达角蛋白10的特点,以链霉卵白素-生物素（SP）免疫组织化学染色法检测加压前后表皮干细胞和终末分化细胞的变化情况。【结果】1)扩张皮肤的表皮层明显增厚,不仅其基底层K19、p63、K14和PCNA阳性细胞的数量明显增多,而且在棘层和颗粒层可见K19、p63、K14及PCNA阳性细胞的表达;2)分离、培养的表皮干细胞K19免疫组化染色阳性,细胞周期分析有84.80%的细胞处于G1期;8kPa以上的间歇压应力作用粘附于硅胶膜上的表皮干细胞1周后,其数量明显增多,免疫组化染色发现其中有角蛋白10阳性细胞。【结论】本研究发现皮肤软组织扩张术的应力能诱导大鼠表皮干细胞增殖与分化,皮肤扩张的过程既有应力诱导引起的增殖效应,又有应力造成的微损伤启动的创伤修复效应,是非典型的创面修复的病理生理过程,而在此过程中具有自我更新、无限增殖潜能和再生修复能力的表皮干细胞发挥着关键性的作用;同时也证实8kPa以上的间歇压应力能诱导表皮干细胞增殖分化,进一步提示表皮干细胞对机械应力的响应机制可能是皮肤软组织扩张术获得“额外皮肤”的主要的生物学基础。
二、人胚胎期表皮干细胞与汗腺发生过程关系的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人胚胎期表皮干细胞与汗腺发生过程关系的研究（论文提纲范文）
（1）毛囊上段自体移植修复皮肤创面动物模型的构建和机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词释义表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 构建大鼠触须毛囊上段自体移植修复表皮创面模型 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.材料来源及处理 |
| 3. 实验主要仪器 |
| 4.实验主要试剂 |
| 实验方法 |
| 1.大鼠触须毛囊的提取 |
| 2.拔除毛干大鼠触须毛囊上段自体皮肤创面移植 |
| 实验结果 |
| 1.大鼠触须毛囊形态学观察 |
| 2.拔除毛干的大鼠触须毛囊上段移植至自体背部皮肤创面、阳性对照组、空白组的结果对比 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分SDF-1 诱导大鼠背部皮肤毛囊形成的研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.材料来源及处理 |
| 3. 实验主要仪器 |
| 4.实验主要试剂 |
| 5.主要试剂配制 |
| 实验方法 |
| 1.毛乳头细胞关键分泌蛋白SDF-1 在人头皮毛囊中的表达 |
| 2.外源性SDF-1 诱导大鼠背部皮肤毛囊形成动物模型的构建 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:毛囊干细胞在皮肤撕脱伤创面修复的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和专利授权 |
| 个人情况简介 |
| 致谢 |
（2）毛囊干细胞与毛乳头细胞体外培养重建类毛囊器官（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 毛囊干细胞和毛乳头细胞提取,体外增殖以及鉴定 |
| 1.1 毛囊干细胞提取,体外增殖及鉴定 |
| 1.2 毛乳头细胞提取及体外增殖 |
| 第二章 增殖细胞悬液动物实验 |
| 2.1 毛乳头细胞及毛囊干细胞体外增殖细胞悬液注射法及小室法植入裸鼠背部 |
| 第三章 表皮干细胞对体外类毛囊器官重建之影响 |
| 3.1 含附件皮肤组织工程构建相关研究 |
| 第四章 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间成果 |
| 致谢 |
（3）基于工程化汗腺类器官实现创面功能性修复的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、β2-AR信号通路提高表皮角质细胞干性潜能 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验试剂配制 |
| 1.1.5 HEK、HaCaT 细胞的培养 |
| 1.1.6 用于 RNA-seq 的细胞培养与处理 |
| 1.1.7 RT-PCR法验证重点基因 |
| 1.1.8 Western blot法验证重点基因 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 RNA-seq数据分析 |
| 1.2.2 isoproterenol提升表皮角质细胞干性潜能重点基因验证 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、表皮角质细胞谱系重编程为汗腺样细胞 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.1.5 质粒的构建与获取 |
| 2.1.6 慢病毒包装与收集 |
| 2.1.7 稳定过表达EDA基因的细胞转染与筛选 |
| 2.1.8 稳定过表达EDA基因的验证 |
| 2.1.9 诱导 HEK-E、HaCaT-E 细胞向汗腺样细胞转化 |
| 2.1.10 高通量基因芯片测定汗腺样细胞转录组学变化 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 dCas9 质粒与sgRAN质粒结构示意图 |
| 2.2.2 HEK-E、HaCaT-E细胞稳定过表达EDA基因 |
| 2.2.3 HEK-E、HaCaT-E细胞转分化为汗腺样细胞 |
| 2.2.4 高通量基因芯片测定汗腺样细胞转录组学变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小节 |
| 三、汗腺类器官的体外构建与维持 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 汗腺类器官的构建 |
| 3.1.5 汗腺类器官的鉴定 |
| 3.1.6 微型流量控制芯片诱导汗腺类器官发育 |
| 3.1.7 微型流量控制芯片内汗腺类器官免疫荧光染色 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功利用HEK-E和HaCaT-E细胞构建汗腺类器官 |
| 3.2.2 微流控芯片原理介绍与应用展示 |
| 3.2.4 微流控芯片成功诱导类器官发育出管腔结构 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小节 |
| 四、汗腺类器官促进汗腺体内再生以及加速皮肤创面愈合 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验试剂配制 |
| 4.1.5 裸鼠的饲养 |
| 4.1.6 烫伤模型建立 |
| 4.1.7 细胞/类器官移植 |
| 4.1.8 创面愈合速度测定 |
| 4.1.9 碘-淀粉发汗试验 |
| 4.1.10 小鼠掌垫组织 HE 染色 |
| 4.1.11 小鼠掌垫组织免疫荧光染色 |
| 4.1.12 裸鼠成瘤实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 汗腺类器官移植能缩短创面愈合时间 |
| 4.2.2 经重编程而来的汗腺类器官促进小鼠损伤汗腺修复 |
| 4.2.3 组织切片显示再生汗腺具有管腔结构 |
| 4.2.4 移植细胞后未见肿瘤组织形成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 汗腺类器官—从简单再生向复杂再造的跨越 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）PRP对毛囊干细胞和毛囊生长的影响及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 富血小板血浆对毛囊生长周期的影响 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料和方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 实验试剂和耗材 |
| 1.2.3 实验仪器 |
| 1.2.4 实验方法 |
| 1.2.4.1 富血小板血浆(PRP)的制备及激活 |
| 1.2.4.1.1 钙离子激活PRP(PC)的制备 |
| 1.2.4.1.2 超声激活PRP(PS)的制备 |
| 1.2.4.1.3 超声激活PRP上清液(PSS)的制备 |
| 1.2.4.2 动物实验方法及组织学检测 |
| 1.2.4.2.1 实验动物分组和皮内注射 |
| 1.2.4.2.2 实验动物脱毛 |
| 1.2.4.2.3 皮肤组织冰冻切片 |
| 1.2.4.2.4 组织切片的碱性磷酸酶(AP)染色 |
| 1.2.4.3 统计学分析方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 统计学结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 实验结论 |
| 第二章 富血小板血浆对毛囊干细胞的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂和耗材 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.4.1 PSS的制备 |
| 2.2.4.2 动物实验方法及组织学检测 |
| 2.2.4.2.1 转基因小鼠皮内注射 |
| 2.2.4.2.2 转基因小鼠皮肤组织冰冻切片 |
| 2.2.4.2.3 转基因小鼠皮肤组织Ki67染色 |
| 2.2.4.2.4 转基因小鼠皮肤组织K15染色 |
| 2.2.4.3 统计学分析方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 统计学结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 实验结论 |
| 第三章 富血小板血浆对毛囊细胞的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 HaCaT细胞 |
| 3.2.2 实验试剂和耗材 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.4.1 富血小板血浆(PRP)的制备 |
| 3.2.4.1.1 钙离子激活PRP(PC)的制备 |
| 3.2.4.1.2 超声激活PRP上清液(PSS)的制备 |
| 3.2.4.2 细胞生物学实验方法 |
| 3.2.4.2.1 鼠SKPs的分离和培养 |
| 3.2.4.2.2 鼠SKPs分别与PSS和PC共培养 |
| 3.2.4.2.3 人HaCaT细胞复苏 |
| 3.2.4.2.4 人HaCaT细胞分别与PSS和PC共培养 |
| 3.2.4.3 分子生物学实验方法 |
| 3.2.4.3.1 CCK-8测量 |
| 3.2.4.3.2 细胞死活染色 |
| 3.2.4.4 统计学分析方法 |
| 3.3 实验结果及统计学结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 实验结论 |
| 第四章 富血小板血浆对毛囊真皮乳头的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验试剂和耗材 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.2.4.1 超声激活PRP上清液(PSS)的制备 |
| 4.2.4.2 细胞生物学实验方法 |
| 4.2.4.2.1 鼠表皮干细胞的分离 |
| 4.2.4.2.2 鼠SKPs的分离 |
| 4.2.4.3 动物实验方法 |
| 4.2.4.3.1 毛囊重组实验 |
| 4.2.4.4 统计学分析方法 |
| 4.3 实验结果及统计学结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 实验结论 |
| 第五章 富血小板血浆的蛋白分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂和耗材 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.2.4.1 富血小板血浆(PRP)的制备 |
| 5.2.4.1.1 钙离子激活PRP (PC)的制备 |
| 5.2.4.1.2 超声激活PRP (PS)的制备 |
| 5.2.4.1.3 超声激活PRP上清液(PSS)的制备 |
| 5.2.4.2 分子生物学实验方法 |
| 5.2.4.3 分析方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 实验结论 |
| 第六章 全文总结 |
| 第七章 雄激素性脱发的相关研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 专用名词及缩略语 |
| 攻读学位期间成果 |
| 一、个人简介 |
| 二、发表论文 |
| 三、专着 |
| 四、专利 |
| 五、大会发言 |
| 致谢 |
（5）人成纤维细胞转化为DP样细胞并参与毛囊重建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 毛囊及毛囊周期 |
| 1.2 雄激素脱发及治疗方法 |
| 1.3 毛囊重建 |
| 1.4 DP |
| 1.5 成纤维细胞转化为DP细胞的可行性分析 |
| 1.6 本研究的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂及配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 人DP特征性基因的表达模式 |
| 3.2 多因子诱导人胎儿成纤维细胞转化体系的建立 |
| 3.3 人成纤维细胞与表皮细胞共培养体系的建立 |
| 3.4 多因子诱导体系转化成人成纤维细胞为DP样细胞 |
| 3.5 DP样细胞参与毛囊重建 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 p63在小鼠表皮命运决定过程中时空表达模式的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 展望 |
| 7 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）基于3D生物打印技术的微结构对组织工程表皮中干细胞行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究现况与成果 |
| 研究目的与方法 |
| 第一章 实验仪器和材料 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 实验所用溶液的配制 |
| 第二章 基于3D生物打印技术构建含细胞微结构仿生模型 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 小鼠表皮干细胞的分离与培养 |
| 2.1.2 野生型C57BL/6小鼠足趾部真皮基质匀浆(PD)的提取 |
| 2.1.3 3D生物打印墨水的制备与保存 |
| 2.1.4 构建三种不同构架的3D微结构仿生模型 |
| 2.1.5 流变学参数检测 |
| 2.1.6 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 3D微结构仿生模型的特征 |
| 2.2.2 微结构的机械参数分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 3D微结构仿生模型中小鼠表皮干细胞活性的变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 活/死细胞活性染色技术的应用 |
| 3.1.2 定量计数各个不同观察时间点的细胞活性 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同观察时间点上各组细胞活性的变化 |
| 3.2.2 细胞活性与剪切应力的关系 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 3D微结构仿生模型中细胞聚集成团与细胞增殖 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 荧光显微镜用于连续性观察 |
| 4.1.2 病理冰冻切片与苏木素-伊红染色(HE染色) |
| 4.1.3 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 不同观察时间点上细胞聚集成团的情况 |
| 4.2.2 光镜观察结果与HE染色结果的一致性和差异性 |
| 4.2.3 细胞聚集成团和细胞增殖与剪切应力的关系 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 3D微结构仿生模型中小鼠表皮干细胞定向分化为汗腺细胞 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病理冰冻切片技术 |
| 5.1.2 免疫荧光染色检测各组分化时间点 |
| 5.1.3 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 小鼠表皮干细胞在3D微结构中的起始分化时间点 |
| 5.2.2 分化进程与剪切应力的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 3D生物打印技术的进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（7）基于RNA-seq筛选关键转录因子诱导表皮干细胞定向分化为汗腺细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、实验仪器和材料 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验溶液的配制 |
| 二、小鼠汗腺全发育模型 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)10sb/J小鼠汗腺细胞的纯化与培养 |
| 2.1.2 细胞免疫荧光检测不同时期汗腺细胞角质蛋白的表达 |
| 2.1.3 不同时期汗腺细胞RNA的提取 |
| 2.1.4 Real-time PCR检测不同时期汗腺细胞角质蛋白的表达 |
| 2.1.5 组织切片免疫荧光检测角质蛋白在汗腺细胞的具体表达位置 |
| 2.1.6 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同时期小鼠原代汗腺细胞的形态学观察 |
| 2.2.2 细胞免疫荧光检测不同时期小鼠汗腺细胞角蛋白的表达 |
| 2.2.3 RT-PCR检测不同时期小鼠汗腺细胞角蛋白的表达 |
| 2.2.4 组织切片免疫荧光检测不同时期小鼠汗腺细胞角蛋白的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、关键时间点汗腺与表皮的差异性研究 |
| 3.1 对象与方法 |
| 3.1.1 汗腺细胞与表皮细胞的纯化分离 |
| 3.1.2 组织切片HE染色观察表皮干细胞与汗腺细胞的不同 |
| 3.1.3 细胞免疫荧光检测小鼠表皮干细胞和汗腺细胞中不同角质蛋白的表达 |
| 3.1.4 组织切片免疫荧光检测E12.5和P5小鼠足部皮肤的角蛋白表达差异 |
| 3.1.5 组织切片HE染色观察E12.5小鼠足部表皮干细胞与背部表皮干细胞的一致性 |
| 3.1.6 免疫荧光观察E12.5 小鼠足部表皮干细胞与背部表皮干细胞的一致性 |
| 3.1.7 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 表皮干细胞与汗腺细胞的形态学差异 |
| 3.2.2 组织切片HE染色显示E12.5 小鼠足部皮肤结构与P5小鼠足部皮肤结构的差异 |
| 3.2.3 表皮干细胞和汗腺细胞对不同角质蛋白的表达情况 |
| 3.2.4 组织切片免疫荧光检测E12.5 和P5小鼠足部皮肤的角蛋白表达差异 |
| 3.2.5 组织切片HE染色观察E12.5小鼠足部表皮干细胞与背部表皮干细胞的一致性 |
| 3.2.6 免疫荧光法观察E12.5小鼠足部表皮干细胞与背部表皮干细胞的一致性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、基于RNA-seq测序与生物信息学分析的关键转录因子筛选 |
| 4.1 对象与方法 |
| 4.1.1 通过RNA-seq测序及生物信息学分析筛选出关键转录因子 |
| 4.1.2 Trizol法提取表皮干细胞和汗腺细胞中RNA及蛋白质 |
| 4.1.3 RT-PCR和Western blot法分别检测表皮干细胞和汗腺细胞在基因和蛋白水平对关键转录因子Fox-c1和Irf-6 的表达 |
| 4.1.4 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 通过RNA-seq测序及生物信息学分析筛选出关键转录因子 |
| 4.2.2 关键转录因子的生物信息学和分子生物学验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、关键转录因子在表皮干细胞向汗腺细胞特化过程中的分子机制研究 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 慢病毒的包装 |
| 5.1.2 细胞转染与筛选 |
| 5.1.3 细胞活性的测定 |
| 5.1.4 细胞免疫荧光法检测转染后不同组细胞角质蛋白的表达情况 |
| 5.1.5 Q-PCR法检测转染后不同组细胞角质蛋白的表达情况 |
| 5.1.6 小鼠脚掌深II度烫伤模型的构建以及转染后细胞的注入 |
| 5.1.7 表皮干细胞诱导为汗腺细胞形成的体内检测 |
| 5.1.8 碘-淀粉试验检测小鼠发汗情况 |
| 5.1.9 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 以慢病毒为载体转染小鼠表皮干细胞 14d后细胞形态学变化 |
| 5.2.2 CCK-8 检测表皮干细胞向汗腺细胞转分化的活性变化 |
| 5.2.3 细胞免疫荧光检测表皮干细胞向汗腺细胞的转分化 |
| 5.2.4 实时定量PCR检测表皮干细胞向汗腺细胞的转分化 |
| 5.2.5 组织切片HE染色检测表皮干细胞向汗腺细胞在体内转分化情况 |
| 5.2.6 组织切片免疫荧光检测表皮干细胞向汗腺细胞在体内转分化情况 |
| 5.2.7 碘-淀粉试验检测汗腺功能 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 汗腺发育与汗液分泌的相关机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）Wnt-1的生物信息学分析及其对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文：Wnt-1 的生物信息学分析及其对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究 |
| 第一部分 Wnt-1 的生物信息学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Wnt-1 重组腺病毒的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Wnt-1 对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 人表皮干细胞分化与增殖影响因素的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表及参与发表的文章 |
| 英文论着 |
（9）汗腺发育相关基因及其联用骨髓间充质干细胞促进汗腺再生修复的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 胎儿汗腺发育过程的观察及汗腺发育相关基因的检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 实验方法与步骤 |
| 1.5 统计学方法和数据处理 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 应用汗腺相关基因与BM-MSCs促进汗腺修复的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 实验方法与步骤 |
| 1.5 数据处理与统计学分析 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 5.附图(测序报告) |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 攻读博士学位期间发表文章及参与科研情况 |
| 致谢 |
（10）机械应力对表皮干细胞增殖、分化影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| ABSTRACT |
| 中文摘要 |
| 正文 机械应力对表皮干细胞增殖分化影响的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 皮肤软组织扩张术对大鼠表皮干细胞增殖、分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 压应力对体外培养的表皮干细胞增殖、分化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述一 表皮干细胞及其与创面修复研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 细胞机械应力响应的生物学基础及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
四、人胚胎期表皮干细胞与汗腺发生过程关系的研究（论文参考文献）
- [1]毛囊上段自体移植修复皮肤创面动物模型的构建和机制初探[D]. 倪娜. 汕头大学, 2020(02)
- [2]毛囊干细胞与毛乳头细胞体外培养重建类毛囊器官[D]. 李哲昊. 南方医科大学, 2020(01)
- [3]基于工程化汗腺类器官实现创面功能性修复的初步研究[D]. 陈润开. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]PRP对毛囊干细胞和毛囊生长的影响及机制[D]. 朱美抒. 南方医科大学, 2020(01)
- [5]人成纤维细胞转化为DP样细胞并参与毛囊重建[D]. 赵倩. 中国农业大学, 2017(05)
- [6]基于3D生物打印技术的微结构对组织工程表皮中干细胞行为的影响[D]. 刘煜凡. 南方医科大学, 2017(01)
- [7]基于RNA-seq筛选关键转录因子诱导表皮干细胞定向分化为汗腺细胞的研究[D]. 谢江帆. 天津医科大学, 2016(03)
- [8]Wnt-1的生物信息学分析及其对人表皮干细胞分化与增殖的影响的研究[D]. 李元朝. 第三军医大学, 2008(03)
- [9]汗腺发育相关基因及其联用骨髓间充质干细胞促进汗腺再生修复的研究[D]. 韩兵. 中国人民解放军军医进修学院, 2007(02)
- [10]机械应力对表皮干细胞增殖、分化影响的研究[D]. 刘洋. 第三军医大学, 2006(04)