一、重组人红细胞生成素(rhEPO)注射液的研制、临床应用及产业化生产（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中认为近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
伍三兰,徐佳强,龚卫静,罗立,黄怡菲,吕永宁,张玉,刘易慧[2]（2020）在《振荡溶解速率对注射用重组人促红素体内外活性的影响研究》文中研究表明目的:探讨振荡溶解速率对注射用重组人促红素溶解后体内外活性的影响,为临床应用提供参考。方法:参照中国药典2015年版三部,按酶联免疫法试剂盒说明书测定高、中、低(800,1 600 2 300 min-1)不同振荡速率下注射用重组人促红素及对照药品重组人促红素注射液B和C体外活性;参照通则3522方法,采用近交系6～8周龄雌性BALB/C小鼠测定不同振荡速率注射用重组人促红素及注射液的体内活性;采用单因素方差分析或非参数检验对各组体内外活性结果进行比较。结果:注射用重组人促红素在低速振荡频率时的体内外活性均显着低于其他各组（P<0.01）;中、高速振荡速率组与注射液B和C组的体外活性相当但体内活性仍存在显着差异（P<0.01）。结论:临床配置注射用重组人促红素时应尽量采用中、高速的振荡频率,以尽可能获得更佳的体内生物学活性。
董世建[3]（2020）在《聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制备工艺及质量研究》文中研究说明重组人干扰素α2b（rh IFNα2b）是最早运用基因工程技术实现量产的细胞因子之一,临床上主要用于急慢性病毒性肝炎（乙型、丙型等）、尖锐湿疣、白血病、淋巴瘤、艾滋病相关性卡波济氏肉瘤、恶性黑色素瘤等的治疗。但因其用药间隔短,很多研究人员致力于开发长效干扰素制剂,聚乙二醇修饰技术是解决蛋白质药物半衰期短的有效手段之一。本学位论文采用分子量20KD的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（m PEG-Succinimidyl Carbonate,m PEG-SC）对rh IFNα2b进行修饰,开发了能够获取高纯度聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的制备方法,并对所获产品进行了理化性质、生物学活性、稳定性等质量研究。（1）聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的制备和纯化。采用DOE试验设计,优化p H、投料比、rh IFNα2b浓度等参数,确定PEG-rh IFNα2b的制备工艺;以离子交换层析结合凝胶过滤层析纯化目标物。最优的工艺为:修饰反应在p H7.0、温度2～8℃、时间约4小时、rh IFNα2b浓度为1.8mg/ml～2.7mg/ml、投料比为2.2～3.0条件下,所获PEG-rh IFNα2b单体含量为44%以上;建立的阳离子交换层析、凝胶过滤层析两步纯化工艺,能有效去除修饰反应副产物NHS和副产物游离PEG,所获PEG-rh IFNα2b纯度在95%以上。（2）聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的理化性质和稳定性。所获PEG-rh IFNα2b相对分子质量为39206.6道尔顿,等电点为5.8～6.0,紫外最大吸收峰波长为280nm,电泳纯度为98.1%～98.4%,HPLC纯度为98.08%～99.74%,产品中未检出游离PEG;通过PEG-rh IFNα2b位置异构体电荷性质存在的微弱差异,采用离子交换高效液相色谱可有效分离出电泳条带位置一致的5个位置异构体;将PEG-rh IFNα2b分别置于2～8℃、25±2℃、37±2℃条件下,在不同时间点考察蛋白含量、电泳纯度、HPLC纯度、游离干扰素、比活性、游离PEG等指标,3批PEG-rh IFNα2b原液在2～8℃条件下保存时间12个月,在25℃±2℃条件下保存3个月,37℃±2℃条件下保存2个月,各项考察指标均符合规定,37℃贮存条件下放置3个月纯度检测不合格。（3）聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的生物活性。对《中国药典》中干扰素生物学活性测定法进行专属性和精密度考察。结果表明《中国药典》中收录的干扰素生物学活性测定法测定PEG-rh IFNα2b生物活性专属性强,溶媒和少量游离PEG对PEG-rh IFNα2b生物活性测定无干扰;精密度良好,RSD=14%（n=6）。
刘文君,魏滋鸿,孙英辉,张臣,张星艳,王泽,武卫党,曾勇,李亚卓,傅鹏[4]（2019）在《国产重组人促红素注射液与进口制剂在大鼠体内的药动学对比研究撤稿》文中提出目的对国产重组人促红素注射液（济脉欣）与进口同类型制剂Eprex在大鼠体内的药动学进行对比研究,为实现临床替代提供依据。方法采用1251标记示踪方法测定药物浓度,采用DAS2.0进行药动学参数的计算,在大鼠体内分别进行单次sc 2 000 U/kg济脉欣和Eprex的血浆药物动力学对比研究、药物组织分布对比研究和尿、粪、胆汁排泄对比研究。结果大鼠sc相同剂量（2 000 U/kg）的济脉欣和Eprex后,RA法所得血浆动力学参数:t1/2分别为（15.8±1.67）和（15.6±3.15）h;Cmax分别为（2 527±471）和（2 470±598） mU/mL;tmax分别为（10.3±1.51）和（9.00±2.45） h;AUC0-t分别为（64 196±12 544）和（59 630±9 391） mU/mL.h,TCA-RA法所得血浆动力学参数:t1/2分别为（15.9±4.19）和（16.2±2.45）h;Cmax分别为（2 201±584）和（1 907±517） mU/mL;tmax分别为（10.0±1.27）和（9.00±2.45） h;AUC0-t分别为（53 709±11 992）和（48 519±8623） mU/mL·h。用RA和TCA-RA法测定济脉欣和Eprex@给药后2、8、24、36h各主要脏器及组织药物浓度,显示大部分组织在给药后8 h药物含量最大,然后逐渐降低,各主要脏器及组织药物变化趋势与血浆药物消除一致,没有发现蓄积现象。大鼠sc给药济脉欣和Eprex后,在120h内从尿中分别可回收到给药总量的75.7%和76.2%,在粪中可回收到给药量的14.7%和14.9%。48h内胆汁排泄量为11.4%和10.3%。结论国产重组人促红素注射液济脉欣与国外上市制剂Eprex大鼠sc给药后,主要药动学参数t1/2、Cmax和AUC0-t和AUC0-t基本一致,经统计检验无差异;两种制剂在各组织脏器内的暴露以及尿、粪、胆汁排泄对比也无差异。
王亮[5]（2019）在《肺癌患者并发慢性病贫血发生机制的研究》文中研究表明【目的】研究细胞因子与肺癌患者并发慢性病贫血（Anemia of chronic disease,ACD）的关系,进一步通过研究GDF15等多种细胞因子对hepcidin m RNA表达的影响,探讨肺癌患者ACD的发病机制。【内容】采用ELISA方法检测肺癌不伴贫血与伴ACD、以及经治疗贫血改善后细胞因子变化;利用RT-q PCR检测EPO、TNF-а、IFN-а、IL-6及GDF15干预后对Hep G2细胞hepcidin m RNA表达的影响,在基因水平上研究这些因子与hepcidin的关系,探讨细胞胞因子与肺癌患者ACD的关系。【方法】1.对照组及实验组血清样本的采集与保存。2.肺癌不伴贫血与伴ACD、及伴ACD患者经EPO联合铁剂治疗后,血清细胞因子水平检测。3.细胞因子干预下Hep G2细胞的培养。4.总RNA的提取、逆转录。5.RT-q PCR检测各组Hep G2细胞hepcidin m RNA表达情况。【结果】1.1肺癌不伴贫血组EPO的x±s为9.7713±1.8365 m IU/ml;伴ACD组EPO的x±s为11.1427±2.4196 m IU/ml;两组间P=0.019,与对照组比较P均>0.05。1.2不伴贫血组TNF-а的x±s为47.7287±12.7084pg/ml;肺癌伴ACD组TNF-а的x±s为47.7447±10.9742pg/ml;与对照组比较P均<0.01,但两组间P=0.997。行EPO及铁剂治疗后TNF-а的x±s为46.339±6.5879pg/ml,与治疗前比较P=0.71。1.3不伴贫血组IFN-а的x±s为44.2967±10.9328pg/ml;伴ACD组IFN-а的x±s为44.1515±11.9766pg/ml;与对照组间比较P均<0.01,但两组间P=0.966。治疗后IFN-а的x±s为43.3551±4.4134pg/ml,与治疗前比较P=0.78。1.4不伴贫血组IL-6的x±s为21.4296±4.1447pg/ml;伴ACD组IL-6的x±s为25.0654±5.7418pg/ml;与对照组间比较P均<0.05,两组间P=0.043。治疗后IL-6的x±s为26.5229±5.8669pg/ml,与治疗前比较P=0.412。1.5不伴贫血组IL-1的x±s为27.4579±11.9027pg/ml;伴ACD组IL-1的x±s为27.5482±7.9909pg/ml;与对照组间比较P均<0.05,两组间P=0.974。治疗后IL-1的x±s为27.8543±8.1748pg/ml,与治疗前比较P=0.911。1.6不伴贫血组GDF15的x±s为1328.2018±250.2665pg/ml;伴ACD组GDF15的x±s为1165.6243±284.8024pg/ml;与对照组间比较P均<0.01,两组间P=0.042。治疗后GDF15的x±s为1353.9724±203.7395pg/ml,与治疗前比较P=0.019。1.7不伴贫血组ERFE的x±s为14.1748±4.0978ng/ml,与对照组比较P=0.009;伴ACD患者ERFE的x±s为11.1904±2.5595ng/ml,与对照组比较P=0.913,两组间P=0.01。治疗后ERFE的x±s为13.6387±3.4288ng/ml,与治疗前比较P=0.01。1.8不伴贫血组hepcidin的x±s为84.0033±13.5452ng/ml;伴ACD组hepcidin的x±s为96.3717±14.1686ng/ml;与对照组间比较P均<0.01,两组间P=0.003。治疗后hepcidin的x±s为88.0947±8.0399ng/ml,与治疗前比较P=0.047。2.1 rhEPO组与对照组比较,12小时:5IU/ml组hepcidin mRNA的x±s为0.9653±0.1106（P=0.617）;10IU/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.7050±0.0847（P=0.031）;20IU/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.6113±0.2403（P=0.004）。24小时:5IU/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.321±0.0236;10IU/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.2937±0.0214;20IU/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.2477±0.0185;P均<0.001。2.2 rhTNF-а组与对照组比较,12及24小时各组P均>0.05。2.3 rhIFN-а组与对照组比较,12小时:5ng/ml组hepcidin mRNA的x±s为2.4627±0.7571;10ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为1.8967±0.6091;20ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为2.3017±0.0058;P均<0.01。24小时:5ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为2.5623±0.0446;10ng/ml组hepcidin m RNA x±s为2.625±0.1891;20ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为3.2343±0.2043;P均<0.001。2.4 rh IL-6组与对照组比较:12小时:50ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.9603±0.0731（P=0.636）;75ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为1.3407±0.2943（P=0.044）;100ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为1.94±0.1522（P<0.001）。24小时:50ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为1.8663±0.1392;75ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为2.7413±0.1715;100ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为2.7407±0.1520;P均<0.001。2.5 rh GDF15组与对照组比较:12小时:10ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.8527±0.0397;20ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.7973±0.0309;40ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.6847±0.0881;P均<0.05。24小时:10ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.452±0.0785;20ng/ml组Hepcidin m RNA的x±s为0.2527±0.024;40ng/ml组hepcidin m RNA的x±s为0.2407±0.0255;P均<0.001。【结论】1、EPO联合静脉补铁是治疗肺癌患者ACD的一种安全有效方法。2、肺癌伴ACD患者EPO与对照组比较无明显升高,提示EPO对贫血的代偿不足。EPO可抑制hepcidin m RNA的表达,表明EPO在肺癌患者ACD的发病中起重要作用。应用EPO治疗,一方面通过克服EPO相对不足促进造血,另一方面可能通过影响GDF15、hepcidin等细胞因子间接改善贫血。3、未发现TNF-а、IL-1与肺癌患者ACD发病有明确的相关关系。IFN-а与肺癌患者ACD发病的关系有待进一步研究明确。4、伴ACD与不伴贫血肺癌患者的IL-6、GDF15、ERFE及hepcidin水平存在显着差异,伴ACD的肺癌患者经EPO等治疗贫血改善后,GDF15、ERFE及hepcidin水平均有明显变化,提示它们在肺癌ACD的发病中发挥作用。研究表明IL-6可促进hepcidin m RNA的表达,反之GDF15明显抑制hepcidin m RNA的表达,说明IL-6、GDF15与hepcidin存在密切关系,证明它们可能通过影响hepcidin在肺癌患者ACD发病中发挥作用。
孙飞[6]（2018）在《归脾汤治疗全膝关节置换术后失血性贫血的疗效观察》文中指出目的:观察归脾汤治疗全膝关节置换术后失血性贫血的近期临床疗效。方法:收集2017年6月1日至2018年2月28日于广州中医药大学第一附属医院三骨科行全膝关节置换术后患者共75名,采用随机数字表法分组,将75位患者随机分为中药组、西药组及空白组各25例,中药组口服归脾汤,西药组皮下注射重组人促红素注射液并口服多糖铁复合物胶囊,空白组无药物干预,术前1天、术后第1、3、5、7天查血常规,统计红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞比积（HCT）、网织红细胞（Rtc）、血小板（PLT）,采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。红细胞总数:红细胞总数比较存在统计学差异（P<0.05）,且西药组红细胞总数高于中药组,中药组高于空白组,差异有统计学意义（P<0.05）。术后患者红细胞总数随时间发生相应变化,西药组和中药组红细胞总数从术前1天至术后第3天逐渐降低,随之逐渐上升,空白组术后第5天下降到最低随之逐渐上升。血红蛋白:血红蛋白比较存在统计学差异（P<0.05）,且西药组血红蛋白高于中药组,中药组高于空白组,差异有统计学意义（P<0.05）。术后患者血红蛋白水平随时间发生相应变化,西药组和中药组血红蛋白水平从术前1天开始到术后第3天逐渐降低,随之逐渐上升,空白组术后第5天下降到最低随之逐渐上升。红细胞比积:三组红细胞比积相比,有统计学差异（P<0.05）,西药组高于中药组,中药组高于空白组（P<0.05）,三组患者红细胞比积随时间发生相应变化,从术前1天至术后第3天逐渐下降,之后逐渐上升。网织红细胞:网织红细胞比较存在统计学差异（P<0.05）,且西药组高于中药组,中药组高于空白组,差异有统计学意义（P<0.05）。术后患者网织红细胞随时间发生相应变化,西药组、中药组、空白组从术后第1天至术后第7天,均呈上升趋势,西药组上升幅度高于中药组,中药组高于空白组。血小板:血小板比较存在统计学差异（P<0.05）,中药组高于西药组和空白组,差异有统计学意义（P<0.05）,但西药组和空白组相比该指标无统计学差异。三组患者血小板随时间发生相应变化,西药组、中药组、空白组从术后第1天至术后第7天,均呈上升趋势,中药组上升幅度高于西药组和空白组,西药组与空白组相近。结论:全膝关节置换术后患者服用归脾汤能够提升血红蛋白水平和红细胞压积,改善患者的贫血状态。
曾艳,周佳丽,徐才刚[7]（2017）在《重组人红细胞生成素对骨髓瘤细胞株MPC-11作用的体外研究》文中指出目的:探讨重组人红细胞生成素（recombinant human erythropoietin,rhEPO）在体外对骨髓瘤细胞株有无抗瘤作用及其作用机制,以便为rhEPO治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）提供理论依据。方法:取对数生长期骨髓瘤细胞株MPC-11细胞以1×104/ml密度接种入96孔培养板中。实验设置对照组及rhEPO组（rhEPO终浓度分别为20、40、60、80、100、200、400 U/ml）。在细胞培养后收集各时间点（1、2、3、4、5、6 d）各组细胞,应用CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况,并提取各组细胞上清液,用酶联免疫定量分析（ELISA）法检测细胞上清液中IL-6、IgG和kappa轻链的水平。结果:流式细胞术结果显示:经200 U/ml rhEPO处理后的MPC-11细胞在培养21 d后细胞凋亡率明显高于对照组（P<0.05）;经400 U/ml rhEPO处理后的MPC-11细胞分别培养10、15、21 d后,其细胞凋亡率均分别高于相同时间节点的对照组（P<0.05）,且细胞凋亡率随rhEPO浓度的增加和作用时间的延长而增高（P<0.05）。ELISA结果显示:rhEPO作用MPC-11细胞株15 d,400 U/ml rhEPO组细胞上清液中IL-6水平低于对照组（P<0.05）;而在21 d,经100、200、400U/ml rhEPO作用下细胞上清液中的IL-6水平降低（P<0.05）;培养21 d时,400 U/ml rhEPO组细胞上清液中的IgG、Kappa轻链水平均明显低于对照组（P<0.05）。结论:rhEPO可明显诱导MPC-11骨髓瘤细胞株凋亡,且与剂量和时间相关;可降低MPC-11细胞株所分泌的IgG、Kappa轻链水平,且与作用时间呈正向变化关系。
卞中国[8]（2014）在《重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究》文中研究表明创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury, TBI）是导致患者死亡和长期残疾的主要病因之一，按照病理过程包括原发性损伤（Primary brain injury）和继发性损伤（Secondary brain injury, SBI）。原发性颅脑损伤与外界直接作用有关，难以干预。SBI发生于颅脑损伤后数小时至数天，包括线粒体功能的障碍、炎性反应和细胞坏死、凋亡等，最终导致脑缺血、脑梗死、脑水肿等不良预后，是颅脑损伤患者死亡和致残的主要原因。然而，研究发现，约90％的TBI患者有缺血性改变，缺血缺氧又往往伴随出现，所以TBI后的局部缺血缺氧就成为SBI发生、发展的主要机制之一，血管作为供血、供氧的基本结构，血管新生的相关研究就成为科研工作者和临床医师的研究的热点。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）作为一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，可以通过与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合，一方面直接刺激血管内皮细胞增殖，诱导其迁移和形成官腔样结构；另一方面增加微血管通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial celladhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）作为血管内皮的重要标记物，对新生血管内皮细胞的标记的特异性很强，并参与血管新生过程，可以有效地反应血管新生的程度。近年来的研究证实，促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）对脑创伤、脑卒中、缺血等疾病具有保护性治疗作用，但其具体机制尚不清楚。重组人促红细胞生成素（Recombinant human erythropoietin，rhEPO）是一种通过使用重组DNA技术生产的、含有与天然分离的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，与天然EPO具有相同的生物学特性。Nakano M等人就曾通过小鼠缺血再灌注损伤模型研究得出EPO诱导VEGF产生，进一步促进血管生成的结论。我们假设rhEPO的这种促血管形成作用在大鼠TBI模型中同样适用，那么TBI后rhEPO的干预可能会成为一种新的改善脑外伤预后的治疗方法。第一部分重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤大鼠VEGF分泌及血管新生的影响目的：通过观察应用促红细胞生成素（rhEPO）对大鼠TBI后，不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31的表达变化，探讨rhEPO对TBI后血管新生的影响。方法：成年健康雄性SD大鼠90只，随机分为对照组（Sham组，n=6只）、颅脑损伤组（TBI组，n=42只）和rhEPO干预组（TBI-rhEPO组，n=42只）。通过改良Feeney法建立颅脑损伤（TBI）模型，按伤后留取标本时间分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7个亚组，每亚组各6只，用正常大鼠作为Sham组，TBI-rhEPO组造模后即刻腹腔注射rhEPO注射液（3000IU/kg）及生理盐水（0.5mg/kg）（用作实验第二部分对照），以后每天同一时间点给药一次，Sham组及TBI组于同一时间点腹腔注射等量生理盐水，直至动物被处死。于预定时间点行神经功能损伤评分（NSS），每亚组随机取三只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过PT-PCR检测VEGF、CD31mRNA表达情况；剩余的3只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化，采用免疫组织化学方法（SP法）检测挫伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31蛋白的表达情况，应用显微图像分析系统计算阳性细胞并测定其平均光密度值。结果：（1）RT-PCR sham组SD大鼠脑组织未检测到VEGF及CD31mRNA明显表达，TBI后挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31mRNA的表达均在TBI-6h开始升高，至TBI-3d表达量达到峰值，随后均呈下降趋势，至TBI-14天表达稍减弱，但仍为高表达状态，而VEGF、CD31mRNA的表达呈正相关（r=0.9239，P<0.001），与TBI组比较，TBI-rhEPO组不同时间点大鼠脑组织VEGF及CD31mRNA表达量均明显升高（P<0.05）；（2）免疫组化sham组大鼠脑组织未检测到VEGF及CD31蛋白的明显表达，颅脑损伤后挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31蛋白的表达均在TBI-6h开始表达，至TBI-5d至表达高峰，并持续高表达至TBI-10d，至TBI-14d稍下降，但仍处于高表达状态。与TBI组比较，TBI-rhEPO组不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31蛋白表达均明显升高（P<0.05），且VEGF蛋白表达与CD31蛋白表达呈正相关（r=0.9813，P<0.001）；（3）神经功能评分（NSS） sham组SD大鼠NSS评分为0分，颅脑损伤后，TBI-rhEPO组和TBI组NSS评分均随着时间的推移而逐渐下降，但TBI-rhEPO组下降更明显，且在TBI-24h～TBI-14d，TBI-rhEPO组NSS明显低于TBI组，与TBI组比较，差异有统计学意义（P<0．05）。结论：颅脑损伤早期应用rhEPO，可通过上调VEGF和CD31的表达，进而起到对大鼠颅脑损伤的保护作用。注重于血管新生的靶向治疗，可一定程度减轻挫伤灶及周围脑组织缺血缺氧，阻止脑水肿、脑梗死等不良预后的发生发展，达到改善脑外伤预后的目的。第二部分重组人促红细胞生成素促进创伤性脑损伤大鼠血管新生的相关机制研究目的：通过观察予以渥曼青霉素（wortmannin）干预的TBI后大鼠损伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31的表达变化，探讨rhEPO促进TBI后大鼠血管新生的可能机制。方法：42只健康雄性SD大鼠通过改良Feeney法建立TBI模型后，即刻腹腔注射重组人促红细胞生成素（rhEPO）注射液（3000IU/kg）及wortmannin（0.5mg/kg），以后每天同一时间点给药一次，直至动物被处死，记为TBI-WM组，根据伤后处死时间随机分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7个亚组，每亚组各6只。于预定时间点行神经功能损伤评分（NSS），每亚组随机取三只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过PT-PCR检测VEGF、CD31mRNA表达情况；剩余的3只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化，采用免疫组织化学方法（SP法）检测挫伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31蛋白的表达情况，应用显微图像分析系统计算阳性细胞并测定其平均光密度值。第一部分实验中TBI组及TBI-rhEPO组作为本部分实验对照组。结果：（1）RT-PCR TBI-rhEPO组SD大鼠挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31mRNA的表达，在TBI-6h开始升高，至TBI-3d表达量达到峰值，随后呈下降趋势，至TBI-14d表达稍减弱，但仍为高表达状态；与TBI-rhEPO组比较，TBI-WM组不同时间点大鼠脑组织VEGF及CD31mRNA表达量均明显下降（P<0.05）；（2）免疫组化TBI-rhEPO组SD大鼠脑组织VEGF和CD31的表达，在TBI-6h开始表达，TBI-5d表达量达到高峰，高表达持续至TBI-10d，至TBI-14d稍下降，但表达量仍较高，TBI-WM组不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31蛋白表达均明显下降（P<0.05）；（3）神经功能评分（NSS） TBI-rhEPO组和TBI-WM组NSS均随着时间的推移而逐渐下降，但TBI-rhEPO组下降更明显，且在伤后24h～14d，TBI-rhEPO组NSS明显低于TBI-WM组，与TBI-WM组比较，差异有统计学意义（P<0．05）。结论：rhEPO保护性治疗作用的可能机制是：通过磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K/Akt）途径，上调VEGF的表达，促进脑血管新生，从而发挥神经保护作用。
白燕,李岩异,张颖[9]（2013）在《重组人促红素注射液新工艺研究》文中认为重组人促红素（rhEPO）注射液临床上应用于治疗肾性贫血、外科围手术期的红细胞动员、肿瘤化疗引起的贫血。目前,国产rhEPO注射液均以人血白蛋白作为稳定剂,人血白蛋白在一定程度上会引起机体的自身免疫反应。以3 000 IU/mL EPO制剂为考察对象,通过高温加速试验,检测制剂中rhEPO蛋白体外活性残存率,首先确定了稳定剂中L-精氨酸盐酸盐和L-组氨酸盐酸盐的浓度,之后在稳定剂添加量确定的基础上,筛选了保护剂Tween80的合适浓度为0.006%,NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12 H2O的配比为5/4,pH值为6.106.30。初步筛选出了EPO制剂的新型配方。
陈占红,黄健,曹文明,邵喜英,黄平,蔡菊芬,楼彩金,叶魏武,王晓稼[10]（2013）在《重组人红细胞生成素治疗晚期乳腺癌化疗相关贫血疗效观察》文中研究说明[目的]观察重组人红细胞生成素（rhEPO）对晚期乳腺癌化疗所致贫血的防治疗效。[方法]选择60例以多西紫杉醇为主的联合或单药化疗方案所致晚期乳腺癌贫血的患者（血红蛋白Hb≤110g/L,或化疗后Hb降低≥20g/L）,随机分为两组,治疗组30例原方案化疗结束后48h皮下注射rhEPO4 0000 IU/周,连用8周。对照组30例不给予rhEPO治疗,均服生血宁片2片/次,3次/d,连续8周。[结果]对照组随化疗周期贫血程度上升,而EPO治疗可以明显减少化疗所致的各项血液学指标下降程度（P<0.05）。8周内EPO治疗组完成化疗总周期数为78个周期,对照组为64个周期,化疗完成率分别为86.7%和73.6%,两组差异有统计学意义（P=0.003）;EPO治疗组有3.3%（1/30）患者需要输血,对照组有27.6%（8/29）患者需要输血,两组之间差异有统计学意义（x2=4.96,P=0.026）。[结论]EPO对以多西紫杉醇为主的联合或单药化疗方案所致晚期乳腺癌贫血有一定疗效,维持Hb水平,减少输血要求,为顺利完成化疗提供有力的保障。
二、重组人红细胞生成素(rhEPO)注射液的研制、临床应用及产业化生产（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人红细胞生成素(rhEPO)注射液的研制、临床应用及产业化生产（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）振荡溶解速率对注射用重组人促红素体内外活性的影响研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试药 |
| 1.3 动物 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 振荡溶解体外活性测定 |
| 1.4.1. 1 标准曲线制备 |
| 1.4.1. 2 供试品溶液的制备及体外活性测定 |
| 1.4.2 体内生物学活性测定 |
| 1.4.2. 1 标准品溶液的制备 |
| 1.4.2. 2 供试品溶液的制备 |
| 1.4.2. 3 测定法 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 体外活性测定 |
| 2.2 体内活性测定 |
| 3 讨论 |
（3）聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制备工艺及质量研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 蛋白质药物 |
| 1.1.1 蛋白质药物发展历程简介 |
| 1.1.2 我国蛋白质药物的开发现状 |
| 1.2 干扰素 |
| 1.2.1 α-干扰素 |
| 1.2.2 重组人干扰素α |
| 1.3 蛋白质类药物的修饰方法 |
| 1.3.1 蛋白质的定点突变 |
| 1.3.2 蛋白质的聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG)化修饰 |
| 1.3.3 蛋白质的脂肪酸链修饰 |
| 1.3.4 蛋白质的糖基化修饰 |
| 1.3.5 融合蛋白药物 |
| 1.3.6 微球及脂质体技术 |
| 1.4 聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG) |
| 1.4.1 聚乙二醇的发现 |
| 1.4.2 聚乙二醇的理化性质 |
| 1.4.3 不同空间结构聚乙二醇 |
| 1.5 聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG)化修饰 |
| 1.5.1 聚乙二醇修饰剂 |
| 1.5.2 聚乙二醇修饰位点 |
| 1.6 聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG)化干扰素 |
| 1.7 课题研究背景和意义 |
| 1.8 论文研究主要内容和技术方案 |
| 1.8.1 论文主要研究内容 |
| 1.8.2 技术方案 |
| 第二章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b制备工艺研究 |
| 2.1 材料与仪器设备 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 材料 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 试验内容与方法 |
| 2.2.1 试验内容 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 修饰偶联反应条件的摸索与优化 |
| 2.3.2 聚乙二醇化重组人干扰素α2b的纯化 |
| 2.3.3 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的去除 |
| 2.3.4 游离聚乙二醇(PEG)的去除 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b理化性质研究 |
| 3.1 材料与仪器设备 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要材料 |
| 3.2 试验内容与方法 |
| 3.2.1 试验内容 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PEG-rhIFNα2b的理化性质 |
| 3.3.2 PEG-rhIFNα2b的纯度分析 |
| 3.3.3 位置异构体的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b稳定性研究 |
| 4.1 材料与仪器设备 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 稳定性放样方法 |
| 4.2.2 检测方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b生物学活性研究 |
| 5.1 材料与仪器设备 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 主要材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 专属性 |
| 5.2.2 精密度 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 专属性检测结果 |
| 5.3.2 精密度测定结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
（5）肺癌患者并发慢性病贫血发生机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、血清细胞因子与肺癌患者ACD的关系 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 研究对象 |
| 1.1.3 肺癌患者ACD的诊断 |
| 1.1.4 血清标本的采集与保存 |
| 1.1.5 观察指标及检测方法 |
| 1.1.6 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 各组间细胞因子结果分析 |
| 1.2.1.1 各组间EPO表达水平分析 |
| 1.2.1.2 各组间TNF-а表达水平分析 |
| 1.2.1.3 各组间IFN-а表达水平分析 |
| 1.2.1.4 各组间IL-6 表达水平分析 |
| 1.2.1.5 各组间IL-1 表达水平分析 |
| 1.2.1.6 各组间GDF-15 表达水平分析 |
| 1.2.1.7 各组间ERFE表达水平分析 |
| 1.2.1.8 各组间Hepcidin表达水平分析 |
| 1.2.2 肺癌伴ACD患者行EPO及静脉铁剂治疗后细胞因子的变化情况… |
| 1.2.2.1 肺癌伴ACD患者经EPO联合铁剂治疗后Hb变化情况 |
| 1.2.2.2 rhEPO及静脉铁剂干预治疗后TNF-а的变化 |
| 1.2.2.3 rhEPO及静脉铁剂干预治疗后IFN-а的变化 |
| 1.2.2.4 rhEPO及静脉铁剂干预治疗后IL-6 的变化 |
| 1.2.2.5 rh EPO及静脉铁剂干预治疗后IL-1 的变化 |
| 1.2.2.6 rh EPO及静脉铁剂干预治疗后GDF-15 的变化 |
| 1.2.2.7 rh EPO及静脉铁剂干预治疗后ERFE的变化 |
| 1.2.2.8 rh EPO及静脉铁剂干预治疗后Hepcidin的变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、细胞因子对Hep G2 细胞Hepcidin m RNA表达的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要培养溶液、凝胶及电泳液的配制 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 rh EPO干预后Hep G2 细胞Hepcidin m RNA表达变化 |
| 2.2.2 rh TNF-а干预后Hep G2 细胞Hepcidin m RNA表达变化 |
| 2.2.3 rh IFN-а干预后Hep G2 细胞Hepcidin m RNA表达变化 |
| 2.2.4 rh IL-6 干预后Hep G2 细胞Hepcidin m RNA表达变 |
| 2.2.5 rh GDF15 干预后Hep G2 细胞Hepcidin m RNA表达变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 Hepcidin的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）归脾汤治疗全膝关节置换术后失血性贫血的疗效观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 现代医学对全膝置换术后失血性贫血机制的认识 |
| 1.2 现代医学对全膝置换术后失血性贫血的治疗策略 |
| 1.2.1 造血原材料补充 |
| 1.2.2 促红细胞生成素运用 |
| 1.2.3 自体输血 |
| 1.2.4 异体血输注 |
| 1.2.5 氨甲环酸的使用 |
| 1.2.6 其他方法 |
| 1.2.7 总结 |
| 1.3 传统医学对损伤出血的认识 |
| 1.3.1 血的生成 |
| 1.3.2 血的运行 |
| 1.3.3 血的功能 |
| 1.3.4 损伤血虚证 |
| 1.4 传统医学对损伤出血的治疗 |
| 1.5 归脾汤的临床应用及现代研究 |
| 第二章 临床研究 |
| 2.1 病例来源 |
| 2.2 诊疗方案 |
| 2.2.1 诊断标准 |
| 2.2.2 纳入标准 |
| 2.2.3 排除标准 |
| 2.2.4 剔除标准 |
| 2.2.5 脱落标准 |
| 2.2.6 干预药物与干预方法 |
| 2.2.7 围手术期的治疗 |
| 2.3 疗效指标 |
| 2.4 数据统计 |
| 2.5 技术路线图 |
| 2.6 统计结果和分析 |
| 2.6.1 性别比较 |
| 2.6.2 年龄比较 |
| 2.6.3 手术时间比较 |
| 2.6.4 红细胞总数比较 |
| 2.6.5 血红蛋白比较 |
| 2.6.6 红细胞比积比较 |
| 2.6.7 网织红细胞比较 |
| 2.6.8 血小板比较 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 归脾汤治疗术后失血性贫血 |
| 3.2 小结 |
| 3.3 不足与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（7）重组人红细胞生成素对骨髓瘤细胞株MPC-11作用的体外研究（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 实验材料和试剂 |
| MPC-11细胞株培养 |
| 细胞活性的CCK-8检测 |
| 细胞凋亡的Annexin V/PI双染流式细胞术检测 |
| 细胞上清液IL-6、Ig G、kappa轻链水平的ELISA法检测 |
| 统计学分析 |
| 结果 |
| rh EPO对MPC-11细胞增殖的影响 |
| rh EPO对MPC-11细胞凋亡的影响 |
| r HEPO对MPC-11细胞上清液中IL-6、Ig G、Kappa轻链水平的影响 |
| 讨论 |
（8）重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤大鼠 VEGF 分泌及血管新生的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组人促红细胞生成素促进创伤性脑损伤大鼠血管新生的相关机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）重组人促红素注射液新工艺研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 制剂分装 |
| 2.2 加速试验 |
| 2.3 EPO体外活性检测 |
| 2.4 活性残存率 |
| 2.5 稳定剂的确定 |
| 2.6 稳定剂添加量的优化 |
| 2.7 保护剂Tween80浓度的确定 |
| 2.8 磷酸盐缓冲体系配比及p H的确定 |
| 3 结果 |
| 3.1 稳定剂的确定 |
| 3.2 稳定剂添加量的优化 |
| 3.3 保护剂Tween80浓度的确定 |
| 3.4 磷酸盐缓冲体系的配比及p H值的确定 |
| 3.5 新型配方 |
| 4 结语 |
四、重组人红细胞生成素(rhEPO)注射液的研制、临床应用及产业化生产（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]振荡溶解速率对注射用重组人促红素体内外活性的影响研究[J]. 伍三兰,徐佳强,龚卫静,罗立,黄怡菲,吕永宁,张玉,刘易慧. 中国药师, 2020(03)
- [3]聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制备工艺及质量研究[D]. 董世建. 合肥工业大学, 2020(02)
- [4]国产重组人促红素注射液与进口制剂在大鼠体内的药动学对比研究撤稿[J]. 刘文君,魏滋鸿,孙英辉,张臣,张星艳,王泽,武卫党,曾勇,李亚卓,傅鹏. 药物评价研究, 2019(11)
- [5]肺癌患者并发慢性病贫血发生机制的研究[D]. 王亮. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]归脾汤治疗全膝关节置换术后失血性贫血的疗效观察[D]. 孙飞. 广州中医药大学, 2018(01)
- [7]重组人红细胞生成素对骨髓瘤细胞株MPC-11作用的体外研究[J]. 曾艳,周佳丽,徐才刚. 中国实验血液学杂志, 2017(05)
- [8]重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究[D]. 卞中国. 苏州大学, 2014(11)
- [9]重组人促红素注射液新工艺研究[J]. 白燕,李岩异,张颖. 煤炭与化工, 2013(08)
- [10]重组人红细胞生成素治疗晚期乳腺癌化疗相关贫血疗效观察[A]. 陈占红,黄健,曹文明,邵喜英,黄平,蔡菊芬,楼彩金,叶魏武,王晓稼. 2013华东胸部肿瘤论坛暨第六届浙江省胸部肿瘤论坛论文集, 2013