一、hBMP-3成熟肽与人PDI分子片段在大肠杆菌中的共表达（论文文献综述）
张婷婷[1]（2014）在《小麦蛋白质二硫键异构酶的表达与性质研究及其对面粉品质的影响》文中提出蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）是一种属于硫氧还蛋白家族、存在于各种真核生物内质网中的氧化还原酶。具有催化蛋白质二硫键形成的氧化活性、促使错误配对的二硫键重排的异构酶活性以及指导蛋白质正确折叠的分子伴侣活性。小麦蛋白质二硫键异构酶（wPDI）参与小麦体内麦谷蛋白聚集体二硫键的形成，而PDI对面粉品质的研究较少，所得研究结果也不尽一致。本文以品种为“中优9507”的小麦黄化苗叶片为材料，提取了小麦基因组总RNA，并通过反转录PCR扩增得到wpdi的cDNA。构建了wPDI的原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，采用亲和层析对重组wPDI进行纯化，进行了重组wPDI酶学性质的研究并探讨了添加wPDI对面粉加工品质的影响。具体研究内容及结果如下：（1）成功地克隆了基因wpdi，wpdi全长1548bp，序列比对发现其具有高度保守性，不同小麦品种间的序列相似性高达99%以上，而且wpdi与其它植物的pdi也高度同源，与大麦、柠檬和甘薯PDI的序列相似性分别达到96.7%、60.9%和58.6%。但是，wpdi与酵母pdi和人pdi的序列同源性仅30%左右。（2）构建了wPDI的原核表达载体，将重组表达载pET-30b-wpdi导入表达宿主菌BL21（DE3）表达，并成功诱导表达得到目的蛋白。优化诱导表达条件为：诱导温度22°C，诱导时间6h，诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L。（3）通过超声破碎提取重组菌体中的可溶蛋白后，应用金属螯合层析纯化了目的蛋白wPDI。经酶学性质鉴定，重组wPDI具有较好的异构活性、胰岛素还原活性及分子伴侣活性。重组wPDI能使变性的核糖核酸酶恢复60%的活性，对变性的GAPDH聚集的抑制率达35%，以还原活性定义重组wPDI的酶活，酶活力4.3U/mg，其催化胰岛素还原反应的最适pH为7.0，最适温度为30°C。在pH7-8的PBS缓冲液中稳定性较好，在常温25-40°C时具有较好的温度稳定性。（4）重组wPDI能显着影响面团的形成时间、稳定时间、弱化度及机械耐力系数等面粉粉质参数，随wPDI添加量的增大，面团的面筋强度和耐机械搅拌性能提高；添加过量的wPDI会减弱这种改善效应。面包烘焙实验表明，添加重组wPDI对面包的体积没有显着影响，但面包的柔软度和耐咀嚼性能显着提高。
张润祥[2]（2013）在《重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究》文中认为干扰素（Interferon，IFN）是由动物细胞产生的，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等作用的一类细胞因子。IFN分为I型、II型和新发现的III型，III型干扰素又称为IFN-λs，其氨基酸水平和蛋白质功能与I型相近。由于IFN-λs受体组织分布特异性，IFN-λs主要在呼吸道、消化道和皮肤黏膜组织以及上皮细胞或某些肿瘤细胞发挥抗病毒作用，与IFN-α相比，能够有效地降低毒副作用。在我国，奶牛病毒性传染病如口蹄疫（FMD）、牛病毒性腹泻病（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）等可通过消化道、呼吸道传播的疫病，至今危害仍比较严峻，因此牛IFN-λs成为继IFN-α和IFN-β后，抗病毒制剂研发的一个方向。为深入研究牛IFN-λs的抗病毒活性及其机制，揭示其用于防治牛病毒病的可行性，本研究利用毕赤酵母分泌表达系统表达了无冗余氨基酸的重组牛IFN-λ3，同时酵母分泌表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌表达系统表达了重组牛IFN-β和IFN-γ，深入研究了各重组干扰素的抗病毒活性，比较了IFN-λ3与I型和II型干扰素单独或联合应用抗病毒活性的异同，主要研究内容如下：1.首先在毕赤酵母表达系统实现了无冗余氨基酸重组牛IFN-λ3的可溶性表达。参考酵母密码子使用偏好性，同时考虑自由能和二级结构等要素，将已知的牛IFN-λ3（boIFN-λ3）基因序列优化成适合酵母表达的最优序列，然后利用重叠延伸PCR技术将设计的相互重叠20bp左右的14条寡核苷酸融合，获得boIFN-λ3基因和及其等位基因命名为boIFN-λ3*（1个基因差异使得成熟肽第18位氨基酸不同）。通过酶切连接的方式，成功构建酵母分泌表达载体pPICZαA-boIFN-λ3和pPICZαA-boIFN-λ3*。在毕赤酵母表达系统中通过一系列的筛选鉴定，如阳性重组酵母菌的鉴定，高表达酵母菌株的筛选，诱导表达条件的优化等最终表达了重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白，表达量均可达1.2g/L，均以糖基化蛋白（23kDa大小，占总蛋白70%左右）和非糖基化蛋白（18kDa大小，占总蛋白15%左右）2种形式表达。经硫酸铵盐析和阳离子交换层析获得了纯化蛋白，重组蛋白均具有良好的抗原性，同时制备了抗boIFN-λ3*多抗。在MDBK-VSV系统测定重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白的生物学效价分别为2.39±0.15×106U/mg/ml和2.15±0.40×106U/mg/ml。理化特性方面，重组蛋白均对胰酶敏感，对热较为不敏感（63℃），对酸碱部分敏感（pH2活性下降2倍），可被特异性抗体中和。从重组蛋白的表达、纯化、糖基化分析、理化特性、生物学活性和致细胞毒性等综合分析，重组蛋白boIFN-λ3和boIFN-λ3*没有区别。2.表达纯化了重组牛IFN-α/IFN-β/IFN-γ并初步测定了它们的生物学活性。为比较重组boIFN-λ3与I型和II型IFN的抗病毒活性，酵母分泌表达系统表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌系统表达纯化了重组牛IFN-β和IFN-γ，测定它们的生物学活性分别为1.50±0.98×107、1.25±0.38×104、2.44±0.91×103和0.81±0.21×105U/mg/ml。在MDBK-VSV系统中4种重组干扰素抗病毒效价大小排序为boIFN-α>boIFN-λ3> boIFN-γ>boIFN-β。在EBK和MDBK细胞上利用MTT法测定4种重组干扰素的细胞毒性，结果显示，重组boIFN-λ3和其他IFNs单独或联合应用致细胞毒性均较小。3.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ诱导Mx1蛋白和ISRE启动子活性的研究。经过Western blot检测重组boIFN-λ3在4种上皮细胞源细胞（EBK、BT、MDBK和BMEC）中均能够诱导产生Mx1蛋白。采用双荧光素酶报告基因系统，通过检测ISRE报告基因的表达水平来间接反映干扰素的生物活性。结果显示不同浓度的重组IFNs诱导启动子表达均呈一定程度的剂量依赖性，重组boIFN-λ3和boIFN-γ诱导报告基因的表达水平呈时间依赖性，48h达到较高水平；而boIFN-α和boIFN-β能够快速的诱导报告基因表达，干扰素作用12h即达到较高的水平，且维持到48h。联合应用时部分组合比单独应用时诱导ISRE活性高。因此各IFNs刺激产生的ISRE启动子活性的差异可能是重组boIFN-λ3与其他IFNs协同抗病毒活性的机理之一。4.比较研究了重组boIFN-λ3和重组boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ抗IBRV、FMDV和BVDV的研究。通过TCID50法测定抗IBRV和FMDV活性，抗cpBVDV采用噬斑减数法，抗ncpBVDV采用半定量RT-PCR法。结果显示重组boIFN-λ3和其他3种重组IFNs均具有抗IBRV和FMDV的活性，且呈一定程度的剂量和时间依赖性。其中抗FMDV活性较强，抗IBRV活性较弱。重组boIFN-λ3可条件性的抑制cpBVDV和ncpBVDV的增殖，即在先孵育干扰素后感染病毒时，重组boIFN-λ3可抑制BVDV增殖，反之则没有作用。5.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ协同抗病毒的研究。通过测定干扰素作用后的病毒-细胞混悬液的TCID50，结果显示重组boIFN-λ3抗IBRV时和boIFN-γ协同作用强，抗FMDV时，boIFN-λ3在EBK和BT细胞上均显示出和boIFN-α/boIFN-β明显的协同作用，提示在临床应用时可以联合应用重组boIFN-λ3和其他干扰素。推测协同机制可能与ISRE启动子活化水平及干扰素刺激基因（ISGs）的表达等有关。6. ncpBVDV持续性细胞感染是否影响重组boIFN-λ3抗病毒活性的研究。ncpBVDV（HLJ-11）感染MDBK细胞后在不同浓度重组boIFN-λ3和重组boIFN-α压力筛选下传代8次，通过半定量RT-PCR检测BVDV核酸，结果显示在干扰素压力下，病毒可以耐受干扰素，造成细胞持续性感染，而此种状态下的MDBK细胞仍能感染VSV，且不影响重组boIFN-λ3在此细胞上发挥抗VSV活性，因此这种细胞是耐受BVDV同时对IFN敏感的细胞。另一方面，ncpBVDV预先感染MDBK细胞不影响boIFN-λ3和其他IFNs在此细胞上发挥抗VSV和IBRV的作用。因此，牛IFN-λ3蛋白的研制及其与I型和II型干扰素抗病毒活性的深入比较研究为进一步了解牛IFN-λs的生物学功能提供了理论基础并为抗病毒制剂的制备提供了物质材料。
刘菲[3]（2011）在《天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究》文中认为我国是水禽生产大国,天府肉鹅具有良好的遗传特性,在整个西南地区的占有率很高,养殖规模较大,社会和经济效益显着。随着集约化养鹅业的发展,研究开发出能有效增强鹅疫苗的免疫力和对鹅病毒具有抑制或杀灭作用的生物制剂,对鹅病的有效防治具有重要的意义。IFN-α干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能。本研究采用基因工程及相关技术,借鉴相关研究,对天府肉鹅IFN-α（tf-GoIFNα）进行克隆、表达及其功能与应用研究。1天府肉鹅干扰素-α基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增出其IFN-α基因（tf-GoIFNα）;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对tf-GoIFNα基因的核酸及氨基酸序列进行分析,同时分析13个与其相关的基因序列的相似性及进化情况。实验结果表明,tf-GoIFNα克隆成功,完整的ORF基因全长576个核苷酸,编码191个氨基酸,表达蛋白分子质量为21670.7Da,潜在的信号肽切割部位位于第28位的A（丙氨酸）和第29位的F（苯丙氨酸）氨基酸之间,二级结构主要由0-螺旋（H）和无规则卷曲组成,大致包括10个抗原表位；tf-GoIFNα基因编码的氨基酸序列含有2个潜在的N-糖基化位点,9个潜在的O-糖基化位点,含有5个潜在的磷酸化位点,第一个疏水区同信号肽位置一致,提示信号肽引导蛋白分泌到胞外作用,没有跨膜区,亚细胞定位预测,tf-GoIFNα表达的蛋白大约会有55.6%在细胞外,22.2%在细胞质,l 1.1%在线粒体,11.1%在细胞核；序列分析及比较结果显示tf-GoIFNα与同类的水禽（鸭、鹅）有90%之上的相似性,在进化树中位于同一分支。与狮头鹅的同源性最近,其中核酸相似性达到99.3%,氨基酸相似性达到97.9%；基因密码子特征分析表明,本研究所克隆的tf-GoIFNα为高表达、密码子偏性较高的基因,其密码子偏爱性情况与鸭IFN-α相近,与鸡IFN-α基因的密码子偏爱性有所不同,提示可以参照和借鉴已经开展的鸭IFN-α基因的表达,开展tf-GoIFN-α的表达及进一步的深入研究。2 tf-GoIFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测参照已克隆的tf-GoIFNα完整ORF基因序列设计引物,克隆到了成熟肽基因,基因全长486bp。将成熟肽基因与原核表达载体pET32a连接,构建原核表达载体pET32-mtf-GoIFN-α,并于表达菌Rosetta中表达,成功表达大小为38kDa的蛋白。表达蛋白经过Ni-IMAC亲和层析纯化以及稀释透析复性后,SDS-PAGE显示蛋白己纯化为单一条带。采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性,纯化复性的重组质粒pET32-mtf-GoIFN-α表达蛋白抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5×103U/mmg。并且在GEF和DEF中检测到鹅IFN-α重组蛋白抗VSV效果是一致的。SYBR Green real-time PCR检测,复性后的tf-GoIFNα重组蛋白进行抗GPV,IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显着性差异（P<0.05）,tf-GoIFNα重组蛋白具有抗GPV的活性作用,对GPV病毒的相对抑制率达89.4%。3鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAE50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度,制备兔抗鹅IgG酶标抗体。结果表明：粗提的IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度可达到94.5%；免疫扩散得出兔抗鹅IgG抗血清效价约1：32,抗体酶标后效价为1：3000,具有应用价值。4 tf-GoIFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达为了进一步研究tf-GoIFNα基因的特性和功能,将tf-GoIFNα基因克隆到pcDNA3.1-（+）真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞,应用间接免疫荧光、ELISA和Western-blot法检测GoIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测。结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-GoIFN-α构建成功,目的蛋白在转染12h后就可以被检测出,36h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢；重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子量为38kDa,比预测的分子质量（约21kDaA）大；间接免疫荧光显示,tf-GoIFNα基因产物由细胞核向细胞浆发散；表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒（VSV）及小鹅瘟病毒（GPV）的活性。5tf-GoIFN-α真核表达质粒对GPV-VP3基因疫苗的免疫佐剂效应为检测tf-GoIFN-α真核表达质粒（pcDNA-GoIFN-α）对GPV-VP3基因疫苗的佐剂作用,将pcDNA-GoIFN-α以每只50、100、200μg三个剂量与GPV-VP3基因疫苗一起用肌肉注射法分别免疫28日龄鹅,同时设分子佐剂gIL2对照组、分子佐剂GoIFN-α与gIL2联合免疫佐剂组、空载体质粒pcDNA3.1（+）对照组、小鹅瘟弱毒对照组和空白对照组,接种后第3、7、14、21、28、35、49d采抗凝血用淋巴细胞增殖试验（MTT法）测定鹅外周血T淋巴细胞转化；第3、7、14、21、28、35、49、63、77 d采凝血用间接ELISA法以及中和试验检测血清抗体水平。结果显示：（]）淋巴细胞对ConA的反应能力（OD值）pcDNA-GoIFN-a以不同剂量与GPV-VP3基因疫苗一起免疫鹅后,各实验组的T淋巴细胞增殖反应在第3d基本维持同一水平,从第3d到第28d稳步上升,在28 d达到了最高峰,而pcDNA-VP3免疫组在第35d达到高峰。在第28d,佐剂组的OD值均极显着（P≤0.01）高于pcDNA-VP3基因疫苗组、GPV弱毒组、pcDNA3.1 （+）和生理盐水对照组。GoIFN-α佐剂组只在第21d显着（P<0.05）高于gIL2佐剂组,其他时间点差异不显着。联合佐剂组在第14d、第28d到第49d均显着高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（P<0.05）。（2）外周血抗体IgG水平（OD值）佐剂免疫组的ELISA抗体水平从第3d的增长趋势为先慢后快,至第35d到达最大值,之后逐渐下降,但仍明显高于pcDNA-VP3基因疫苗组和GPV弱毒组。gIL2佐剂组在第28d到第42d和63d到第77d显着高于GoIFN-α佐剂免疫组（P≤0.05）,GoIFN-α和gIL2联合佐剂免疫组在第21d到第77d极显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂免疫组（P≤0.01）。在GoIFN-α佐剂组中,佐剂作用呈一定的剂量相关性。（3）外周血中和抗体效价在免疫后第60d和第75d,GoIFN-α/gIL2联合佐剂组极显着（P≤0.01）高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（表8-5）。佐剂组的中和抗体效价在第45d到第75d期间均显着（P≤0.05）或极显着（P<0.01）高于pcDNA-VP3组。GPV弱毒组在第45d显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂组诱导的中和抗体水平（P≤0.05）,与GoIFN-α和gIL2联合佐剂组所诱导的中和抗体水平差异不显着。整个检测过程中,注射pcDNA3.1（+）和生理盐水的鹅对照血清不能保护细胞对抗病毒的感染。实验证明,pcDNA-GoIFN-α能使GPV-VP3基因疫苗诱导的T淋巴细胞转化能力增强,血清抗体IgG水平和中和抗体效价升高,是一种良好的增强GPVVP3基因疫苗的分子佐剂,分子佐剂goIFN-α和golL2联合免疫组效果最佳,pcDNA-goIFN-α肌肉注射200μg/只的效果次之。6 tf-GoIFNα在毕赤酵母中的分泌表达及其活性检测为了更好的利用基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂,应用PCR技术从含有tf-GoIFNα完整ORF的重组质粒pMD18-T-GoIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因,亚克隆于穿梭载体pPICZαA上,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经sacⅠ线性化后,电转化入酵母表达菌X33；1%的甲醇诱导表达3株不同的菌72小时后,斑点杂交筛选出高拷贝的转化子,Elisa法鉴定筛选最佳表达时间和甲醇浓度。重组子经诱导表达,TCA浓缩后,SDS-PAGE和Western-blot分析,并采用微量细胞病变抑制法分析研究其生物活性。结果表明,成功构建了重组鹅IFN-α的酵母表达质粒,并实现了其在毕赤酵母中的分泌表达；SDS-PAGE和Western-blot分析显示获得分子量约为22kDa的表达蛋白,比预测的蛋白分子量（18.7kDa）略大,估计是糖基化的原因；表达产物对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/mL。
张升祥[4]（2009）在《家蚕气味结合蛋白基因的研究》文中研究指明家蚕是和人们的生产、生活联系最密切的昆虫,是目前唯一完成全基因组测序的鳞翅目昆虫,是国际鳞翅目学会公认的鳞翅目模式生物;数十年来,蚕蛾还一直是研究蛾类嗅觉接受和传导的模式昆虫,其中气味结合蛋白（以性信息素结合蛋白为主）是研究的热点之一。气味结合蛋白（Odorant binding proteins,OBPs）在昆虫和外界环境化学信息交流过程中起着重要作用,对昆虫觅食、求偶、繁殖具有重要意义。因此,开展家蚕气味结合蛋白的研究对进一步认识其功能,阐明家蚕的嗅觉机制,以及利用昆虫嗅觉进行害虫治理和益虫饲养具有重要理论和实践意义。为此,本文利用生物信息学、基因定位、基因表达谱分析、基因克隆、RNAi、分子进化分析和分子标记等方法研究了家蚕气味结合蛋白基因家族的基因结构、定位、表达谱、功能,以及家蚕对人工饲料摄食性相关的分子标记。主要结果如下:1对NCBI公布的家蚕OBPs家族生物信息学分析发现,该家族基因分布于7条染色体上,形成4个基因簇;基因的结构多态性明显,核苷酸序列相似性、遗传距离差距较大;家蚕OBP基因的电子表达谱广,多个基因在多种组织中具有表达。对OBP家族蛋白质分析发现,该家族的生化特性和昆虫OBP蛋白基本类似,其中可能有2个蛋白为跨膜蛋白,5个膜相关蛋白,蛋白质的疏水性区域类似;序列一致性较低,遗传距离差异大,但半胱氨酸和色氨酸非常保守;家蚕的OBP家族同样存在Minus-C类群,但未发现Plus-C类群基因。结果表明,OBP家族可能具有多种功能。2性信息素结合蛋白/普通气味结合蛋白（Pheromone binding protein/general binding protein）是鳞翅目昆虫OBP家族的一个重要单系群。染色体上定位发现这些基因以基因簇的形式存在于第19染色体的nscaf3052上,基因结构相似,转录方向一致,表明这些基因可能由同源基因复制产生,并具有类似功能;对其潜成虫和成虫阶段多个发育时期的雌、雄虫多种组织中进行表达分析,发现这些基因在不同发育时期的不同组织间差异明显,相对表达量均以触角中为最高,其它非嗅觉组织中也多有表达,性别间差异不大,说明了该基因簇基因除了具有嗅觉相关的功能外,很可能具有其它尚未被发现的功能;而蚕蛾趋性反应结果说明,蚕蛾的嗅觉反应以雄蛾对性引诱的应答为主,而对幼虫期敏感的引诱物或忌避物没有反应,成虫期OBPs的主要功能可能和感受性信息素刺激有关。3对家蚕幼虫期ABP（Antennal binding protein）和ABPX（Antennal binding protein X）基因的蛋白质结构、功能位点、基因表达和功能分析发现,这2个蛋白差异较大,分属不同的OBP群;且这2个基因在嗅觉组织（器官）中均有较高的表达量,但并非仅在嗅觉器官中表达,基本上在所检测的组织中均有表达。摘除实验结果显示,二者可能和幼虫对食物的趋性相关;但5龄期注射dsRNA和口服细菌表达的dsRNA实验表明,RNAi能够显着降低目的基因的表达,但未引起家蚕的嗅觉失灵,而对家蚕幼虫5龄期的发育经过有明显的延缓作用。这些结果表明,这2个基因在幼虫期可能和幼虫的对食物的趋性相关,并具有其他重要的、和发育相关的生理功能。4克隆得到了野桑蚕性信息素感受过程中的重要基因PBP1、PBP2、PBP3、OR1和OR3。序列分析发现,家蚕和野桑蚕基因间的遗传距离很近,基因变异较小,且以转换为主,核苷酸变异未引起蛋白质二级结构的变化,其重要的功能位点也未发生变异,推测其基因的功能未发生变化,故二者能够相互感受、识别。为通过杂交开发、利用野桑蚕资源提供了理论依据;同时,这也是家蚕起源于野桑蚕的分子证据。5普遍认为,GOBP（general OBP）具有结合食物和环境中各种普通的气味分子的能力。对13种昆虫GOBP亚家族分子进化分析结果表明,GOBP1和GOBP2氨基酸和核苷酸的一致性很高,序列差异性很小,其亲缘关系非常近,其中半胱氨酸和色氨酸非常保守,但是它们来自不同的祖先基因,并在物种分化之前已经分化完成。基于氨基酸序列的ω分析表明,Ka/Ks率一般都很低,仅在烟夜蛾和棉铃虫GOBP1的分化进化过程中受到正向选择作用,而在其他分化过程中均未检测出正向选择作用。表明GOBP基因在昆虫间可能具有相似的功能。6家蚕的食性相关分子标记研究表明,家蚕对人工饲料育摄食性相关性状可能主要受不食基因控制;RAPD标记结果具有明显的多态性,SSR标记的多态性较少,其对应的特异引物主要为染色体第10、11、17、19、20、27、28号上的标记,其中以第20号染色体的标记最多,且多为高摄食性亲本的特异性条带,说明家蚕对人工饲料摄食性的基因很可能位于其上;而位于17号染色体的标记扩增出的特异性条带多来自于低摄食性亲本,表明家蚕对人工饲料不食基因可能位于其上。这为进一步确定食性相关性状的分子标记,利用分子标记辅助育种,培育对人工饲料育高摄食性品种奠定了基础,有助于产业进步,也有利于害虫的防治和其他益虫的饲养。
唐辉桂[5]（2008）在《植酸酶高效生产菌株74#的改良》文中研究表明植酸酶是一种可以水解植酸的磷酸酶类,能够分解饲料中的植酸为动物可利用的无机磷和肌醇,已经在动物营养,人类营养以及酶法合成低磷酸肌醇方面有了很广的应用范围。但目前,提高植酸酶生产菌株的单位表达量,进一步降低其生产成本仍然是最重要的植酸酶产业目标之一。本研究以目前植酸酶表达量最高的实际生产菌株74#为材料,通过共表达二硫键异构酶、透明颤菌血红蛋白,增加基因拷贝数等方法,以期进一步提高其表达量,降低生产成本。本研究也对毕赤酵母表面展示植酸酶进行了尝试。根据已发表的毕赤酵母来源二硫键异构酶（PDI）基因序列,克隆获得PDI编码基因,并构建了含有PDI编码基因的毕赤酵母胞内表达载体pPICZA-pdi,以植酸酶生产菌株74#为受体进行了转化。从600个转化子中筛选到3个酶活性更高的重组子,其中酶活性最高的49#菌株其活性是原有菌株74#酶活性的120%,在5L发酵罐中表达活性达到16,582 U/mL。在此基础上,用经密码子优化的大肠杆菌植酸酶基因appA-m,构建了表达载体pPIC9K-appA-m。以共表达PDI蛋白的植酸酶菌株49#为受体,筛选重组子后得到多拷贝的植酸酶菌株79#,酶活性达到17,434 U/mL,与共表达PDI蛋白的49#菌株相比,提高了10%;与生产菌株74#相比,提高了34%。根据已发表的树干毕赤酵母基因组序列克隆了低氧启动子PsADH2 promoter序列,并根据已发表的透明颤菌血红蛋白序列,按照毕赤酵母密码子偏爱性对血红蛋白基因进行了密码子改造和合成。构建了表达载体pPIC9K-PsADH2-vgb-m,以植酸酶生产菌株74#为受体进行了转化。对重组子进行筛选得到低氧条件下植酸酶活性最高的转化子15#,利用摇瓶培养,其在低氧条件下的酶活性是74#菌株酶活性的4倍,达到249 U/mL。另外,本研究对表面展示植酸酶进行了尝试。通过已发表的啤酒酵母基因组序列克隆了α凝集素蛋白AGα1编码基因,构建了表达载体pPIC9K-appA-m-AGα1,转化毕赤酵母,对重组子进行筛选,得到了在酵母细胞表面有植酸酶活性的菌株。
陈鸿军[6]（2006）在《MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白转导功能研究》文中研究说明血清I型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1）的UL49h基因与I型单纯疱疹病毒（HSV-1）UL49同源,编码病毒被膜蛋白VP22,分子量约27.6kD,是病毒被膜的主要成分。现已证实,MDV-1 VP22对病毒的复制和传播有着非常重要的作用。Dorange等发现MDV-1 VP22具有与HSV-1相似的蛋白转导功能。Hung等研究发现MDV-1 VP22能增强人16型乳头状瘤病毒（HPV-16）E7抗原融合表达的免疫效果,主要产生CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答。本研究利用无致病性的CVI988/Rispens疫苗株扩增VP22基因,结果发现其C端缺失6个氨基酸,即201TKSERT206,对CVI988 VP22蛋白转导功能的研究结果提示:CVI988 VP22可作为一种高效便捷的蛋白转运工具,对于弥补DNA免疫缺陷和提高治疗性物质的转导效率具有非常重要的意义。1不同致病型马立克氏病病毒VP22蛋白的序列比较和分析用MDV-1 CVI988/Rispens株、GA株、RB1B株和648A株,MDV-2 Z4株和FC126株分别感染鸭胚成纤维细胞或鸡胚成纤维细胞,待出现大量空斑时,提取总DNA。根据已发表的MDV GA株VP22序列设计引物,成功扩增出MDV-1不同毒株的VP22基因。将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现:强毒株GA株、超强毒RB1B株和特超强毒648A株的VP22长度保持750bp,但CVI988弱毒株的VP22基因C端缺失18bp,即存在一个6氨基酸残基的缺失性突变:201TKSERT206。2 CVI988弱毒疫苗株VP22羧基端原核表达及特异性抗体的制备设计特异性引物,扩增全长VP22、CVI988 VP22的羧基端区域（VP22C:aa94243）、VP22末端区（VP22T:aa207249）、缺失N端的VP22（VP22H:aa19243）。将BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切PCR产物,克隆入pGEX-6P-1载体中,转化BL21（DE3）细菌,经IPTG诱导表达,结果发现:VP22C获得了高效可溶性表达。SDS-PAGE分离阳性条带,采用切胶免疫或用诱导后的细菌经超声波裂解的
李文星[7]（2006）在《重组人透明带蛋白3的高密度发酵表达及食蟹猴的免疫研究》文中认为卵透明带（zona pellucida，ZP），是哺乳动物卵子外包裹的一层半透明的糖蛋白基质，是精子与卵细胞识别和结合的部位，同时对卵子起保护作用。卵透明带的生理特性极具研究价值，ZP蛋白的特性使之具有开发成避孕疫苗的潜力，然而，ZP是极具组织特异性的蛋白，天然存在量很少。为了得到大量高纯度的ZP3蛋白进行深入的抗生育疫苗和免疫不孕诊断的研究，我们重组表达了人ZP3成熟肽片段。 本研究克隆了hZP3成熟肽（第23～383位氨基酸序列）的基因片段，运用基因工程方法将其重组到穿梭型载体质粒pPICZaA上，选择测序正确的重组质粒，在大肠杆菌中扩增质粒、Sac Ⅰ线性化后使用电击转化的方法把重组基因转入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），用高浓度的Zoecin筛选到整合了高拷贝重组基因的酵母菌株，通过SDS-PAGE和Western Blotting方法鉴定甲醇诱导表达的重组蛋白，借助发酵罐进行高密度发酵表达rhZP3，目的蛋白利用载体质粒上设计的6个组氨酸纯化标记，以Ni2+螯合柱亲和层析法纯化，纯化后的rhZP3使用胞壁酰二肽（Muramyldipeptide，MDP）佐剂免疫灵长类动物食蟹猴（Macaca fascicularis），以猪ZP3包被抗原用ELISA检测抗血清，并用小鼠卵巢冰冻切片与人卵巢石蜡切片进行免疫组化鉴定，用猴抗rhZP3抗血清进行体外抗小鼠精卵结合实验以评价抗血清的抑制受精能力。 结果表明，在载体质粒中成功克隆了hZP3成熟肽的cDNA序列，用重组质粒转化并筛选得到可以稳定表达rhZP3的重组酵母，Western Blotting鉴定重组蛋白具有免疫学活性，通过发酵罐高密度表达后纯化得到高纯度的rhZP3，以之免疫食蟹猴，获得了较高滴度的抗hZP3抗体，抗体与猪ZP3有交叉反应性，猴抗rhZP3抗血清可以与小鼠和人卵母细胞上的透明带发生免疫反应，并在体外明显能抑制小鼠卵子结合精子。 研究结果说明，重组hZP3的确可以在酵母中分泌表达，并具有与天然蛋白相似的活性；抗rhZP3抗血清在体外体现了封闭透明带、阻断受精的活性。重组蛋白可以满足开发抗生育疫苗和免疫不孕诊断的需求。
崔先利[8]（2006）在《抑制素基因疫苗pCISI免疫南阳黄牛试验研究》文中提出本实验应用分子克隆、基因免疫、酶免疫测定、放射免疫等技术，研究抑制素基因免疫对黄牛抗抑制素抗体产生、生殖及生殖内分泌的影响，通过比较不同免疫原纯度、免疫剂量和免疫次数的免疫效果，探索最佳抑制素基因免疫方案，达到有效提高动物生殖力、降低实际成本、推广繁育新技术的目的。本研究的主要内容如下： 1．南阳黄牛对抑制素基因疫苗pCISI的免疲反应性研究 为分析黄牛对抑制素基因免疫的免疫反应性及其影响因素，本实验采用不同剂量、不同纯度的双拷贝抑制素融合质粒pCISI免疫两次免疫黄牛。结果表明：首次免疫10天后即产生了一定的抗抑制素抗体，首次免疫期间整个免疫组的抗体P／N值显着高于对照组（P＜0.05），加强免疫期间抗体P／N值极显着高于对照组（P＜0.01），抗体阳性牛的比例由16.83％提高到52.75％，前后差异显着（P＜0.05）。无论是抗抑制素抗体水平还是抗体阳性率，四个剂量组（0.75mg、1.5mg、2.25mg、3.0mg）组间均无明显差异（P＞0.05），其中，以3.0mg剂量组产生的抗抑制素抗体水平最高（1.97±0.62），2.25mg剂量组的抗体阳性率最高（56.62％，13／23）。高纯度pCISI(OD260／OD280介于1.8～2.0)的免疫效果略高于低纯度组(OD260／OD280介于1.7～1.8和2.0～2.1)，但两个纯度组组间无显着性差异（P＞0.05）。结合本次研究涉及的剂量与纯度，低纯度组中0.75mg抑制素融合质粒pCISI引起的免疫应答效果最佳，高纯度组中2.25mg抑制素融合质粒pCISI最佳。2.25mg和3.0mg剂量组中，高纯度组的抗体阳性率在全期显着高于低纯度组（P＜0.05），但平均抗体P／N值无显着性差异（P＞0.05）。无论是抗体阳性率还是抗体P／N值，其余两剂量的高、低纯度组组间在各个免疫阶段均无显着性差异（P＞0.05）。研究表明，融合到乙肝表面抗原上的抑制素基因的表达产物在大型动物黄牛体内同样具有较强的抑制素免疫学活性，免疫效果随着免疫次数的增加而有所提高，但并没有完全随着免疫原剂量的增加、纯度的提高而提高。 2．抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖及生殖内分泌的影响 为探讨抑制素基因免疫对黄牛生殖及生殖内分泌的作用，本实验采用不同剂量（0.75mg、1.5mg、2.25mg、3.0mg）、不同纯度（高、低）的抑制素融合质粒pCISI两次免疫黄牛。结果发现，免疫组平均每头牛的成熟卵泡为1.99±0.99个，胎儿为1.35±0.50头，至少具有两个成熟大卵泡的牛的比例达61.29％，双胎率达35.14％，显
刘永斌[9]（2005）在《牛骨形态发生蛋白BMP-4 cDNA的克隆及序列分析》文中指出本研究从影响肉牛骨骼生长发育的 BMP 基因出发,利用 Genbank 中其他物种的序列信息,通过序列比对、分析和 PCR-RACE 方法,对尚未报道的牛 BMP-4 基因序列进行扩增、克隆及测序。方法:1、在 Genbank 中查找人、小鼠和羊的 BMP-4 基因序列,运用 DNAStar 软件对这些序列进行同源性分析。依据同源性较高外显子区域设计引物。首先提取牛血液基因组 DNA,采用 PCR 技术扩增牛 BMP-4 的部分序列,将此片段重组到 PMD18-T 载体中,双酶切和 PCR 鉴定后测序,获得长为 306bp 的牛BMP-4 部分外显子序列。2、通过已获得的 BMP-4 序列设计 PCR-RACE 的上游特异引物,从牛软骨中提取总 RNA,用 Oligo（dT）15 Adaptor primer 和所设计的上游特异引物进行 PCR-RACE,通过克隆、测序后获得一条包括 3′末端非翻译区和大部分编码区序列,并与已获得外显子序列拼接得到长度为 1306bp 的基因序列。通过序列分析,发现 3′端氨基酸序列含有 BMP 家族固有特定位置的 7 个半胱氨酸,并与其他物种包括人、羊、小鼠、大鼠、狗和鸡的核苷酸序列同源比对,发现它们的同源性分别为 90.2%、94.2%、90.9%、90.4%、85.4% 和 73.6%,证实克隆的序列为牛 BMP-4序列,同时进行了氨基酸序列的预测和分析,克隆片段编码 389 个氨基酸,3′末端非翻译区长为 121bp,与人、羊、鼠、狗和鸡的同源性很高,为克隆其他 BMP 家族成员提供了依据。此序列已登陆 Genbank,登陆号:AY854957。
陈雅娟[10]（2004）在《人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达及其纯化》文中研究表明骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），通常也称之为骨形态发生蛋白或骨生成素，是一类广谱性的生长调节因子。已有的研究表明，BMPs的功能不仅仅局限于能诱导未分化的间充质细胞不可逆地转化为软骨和骨，BMPs还对组织器官的胚胎发生和形态形成起重要作用。另外，BMPs还参与调节包括间充质细胞、上皮细胞、造血细胞和神经细胞在内的多种细胞的增殖、分化、趋化性和调亡。 有研究表明，不同种BMP实现共表达后，活性比单种表达时有显着的提高，如人骨形成蛋白-4（hBMP4）与人骨形成蛋白-7（hBMP7）在CHO细胞实现共表达后，活性比人骨形成蛋白-4单种表达时提高5倍另有研究表明，BMP异源二聚体的生理效应要比同源二聚体高10～20倍之多。因此，本研究尝试利用hBMP4和hBMP7的成熟肽cDNA片段制备转基因酵母菌株，从而对hBMP4与hBMP7在毕赤酵母细胞共表达的实现和hBMP4／7异源二聚体的形成进行探讨。 本论文的主要工作包括hBMP4与hBMP7在毕赤酵母细胞中共表达技术的建立：hBMP4与hBMP7的发酵工艺；蛋白纯化工艺；抗原反应活性及理化性质的研究。 摇瓶培养确定最适培养基为BMGY／BMMY；培养基的最适pH值为6.0；最佳甲醇诱导浓度为1％；最适诱导周期为96小时。 经斑点印迹和蛋白质印迹证实了表达产物含有hBMP4与hBMP7，均具有良好的抗原性和特异性。 经还原性和非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合蛋白质印迹鉴定，所获得的hBMP4与hBMP7为单体蛋白，分子量分别为26KD和17KD。 利用Bradford蛋白质定量法并结合Glyko BandScan量化软件的分析发现，表达上清中hBMP4表达量达到33.34mg／L，占总蛋白含量的50.4％，hBMP7的表达量达到13.76mg／L，占总蛋白含量的20.8％。 用阳离子交换层析法结合疏水柱层析法进行纯化，最终纯化得到的目的蛋白纯度达到80％以上。
二、hBMP-3成熟肽与人PDI分子片段在大肠杆菌中的共表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、hBMP-3成熟肽与人PDI分子片段在大肠杆菌中的共表达（论文提纲范文）
（1）小麦蛋白质二硫键异构酶的表达与性质研究及其对面粉品质的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 工业中常用的面粉增筋剂 |
| 1.2.1 酶制剂类增筋剂 |
| 1.2.2 化学类面粉增筋剂 |
| 1.3 蛋白质二硫键异构酶的研究进展 |
| 1.3.1 PDI的来源 |
| 1.3.2 PDI的结构特征 |
| 1.4 PDI的功能特性 |
| 1.4.1 PDI催化二硫键的形成与异构 |
| 1.4.2 PDI的分子伴侣活性 |
| 1.4.3 PDI的其它功能 |
| 1.5 PDI的克隆表达 |
| 1.6 关于PDI应用的研究 |
| 1.6.1 在基因工程中的应用 |
| 1.6.2 PDI的工业应用探索 |
| 1.7 大肠杆菌表达系统 |
| 1.8 本论文的重要意义及主要研究内容 |
| 1.8.1 研究意义 |
| 1.8.2 主要研究内容 |
| 第二章 重组wPDI原核表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 常用培养基及试剂的配制 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）、C43（DE3）感受态细胞的制备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小麦黄化苗叶片总RNA的提取 |
| 2.3.2 反转录PCR |
| 2.3.3 回收及纯化wdpi的PCR产物 |
| 2.3.4 wpdi的PCR产物加A尾及回收纯化 |
| 2.3.5 构建wpdi的重组克隆载体 |
| 2.3.6 wPDI原核表达载体的构建 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 小麦黄化苗总RNA的提取 |
| 2.4.2 反转录PCR扩增wpdi的目的基因 |
| 2.4.3 wpdi基因的克隆载体的构建 |
| 2.4.4 克隆wpdi基因的序列比对 |
| 2.4.5 wPDI氨基酸序列分析 |
| 2.4.6 wPDI表达载体的构建 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 重组wPDI的表达与纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 主要试剂材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 常用溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组表达菌株的构建 |
| 3.3.2 重组wPDI的小量诱导表达 |
| 3.3.3 SDS-PAGE |
| 3.3.4 Western-blot |
| 3.3.5 表达条件优化 |
| 3.3.6 发酵培养 |
| 3.3.7 重组wPDI的可溶性分析 |
| 3.3.8 亲和层析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重组表达菌株的构建及诱导表达 |
| 3.4.2 Western-blot鉴定 |
| 3.4.3 诱导条件的优化 |
| 3.4.4 重组wPDI的可溶性分析 |
| 3.4.5 亲和层析纯化重组wPDI |
| 3.4.6 目的蛋白浓缩除盐 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 重组wPDI的酶学性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂及材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组wPDI的异构酶活性 |
| 4.3.2 重组wPDI的还原酶活性 |
| 4.3.3 重组wPDI还原反应的最适反应温度和最适反应pH |
| 4.3.4 重组wPDI温度稳定性和pH稳定性研究 |
| 4.3.5 重组wPDI的分子伴侣活性 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 重组wPDI的异构酶活性 |
| 4.4.2 重组wPDI的还原酶活性 |
| 4.4.2.1 重组wPDI的最适添加量 |
| 4.4.2.2 重组wPDI还原反应的最适pH |
| 4.4.2.3 重组wPDI还原反应的最适温度 |
| 4.4.2.4 重组wPDI的最适反应时间 |
| 4.4.2.5 重组wPDI的pH稳定性 |
| 4.4.2.6 重组wPDI的温度稳定性 |
| 4.4.3 重组wPDI的分子伴侣活性 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 重组wPDI对小麦面粉品质的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 主要材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 重组wPDI对面粉粉质特性的影响 |
| 5.3.2 重组wPDI的面包烘焙实验 |
| 5.3.3 面包芯质构分析 |
| 5.3.4 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 重组wPDI对面粉粉质特性的影响 |
| 5.4.2 重组wPDI对面包烘焙品质的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、研究创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 IFN-α、IFN-β和 IFN-γ概述 |
| 1.2 IFN-λs（III 型干扰素）研究进展 |
| 1.2.1 基因及蛋白结构 |
| 1.2.2 表达和调节 |
| 1.2.3 IFN-λs 的受体 |
| 1.2.4 信号转导 |
| 1.2.5 抗病毒 |
| 1.2.6 抗肿瘤活性 |
| 1.2.7 免疫调节活性 |
| 1.3 牛干扰素研究进展 |
| 1.4 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 1.4.1 毕赤酵母及其他常用表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母可溶性表达影响因素 |
| 1.4.3 利用毕赤酵母表达干扰素的研究 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 细胞、病毒、培养基、血清 |
| 2.1.3 酶、抗体、生化试剂和耗材 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 牛 IFN-λ3（boIFN-λ3）在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 2.2.2 重组牛 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的表达 |
| 2.2.3 重组牛 IFN-λ3/IFN-α/IFN-β/IFN-γ生物学活性初步测定 |
| 2.2.4 重组牛 IFN-λ3 的理化特性分析 |
| 2.2.5 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的细胞毒性检测 |
| 2.2.6 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ比较对 Mx1 蛋白和 ISRE 活性的影响 |
| 2.2.7 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究 |
| 2.2.8 ncpBVDV 持续性细胞感染对重组牛 IFN-λ3 抗病毒活性影响 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 牛 IFN-λ3 在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 3.1.1 牛 IFN-λ3 的基因优化 |
| 3.1.2 牛 IFN-λ3 PCR 扩增 |
| 3.1.3 重组表达载体 pPICZαA-boIFN-λ3 的构建和鉴定 |
| 3.1.4 重组 boIFN-λ3 酵母菌株的筛选鉴定 |
| 3.1.5 高表达重组酵母菌株的筛选 |
| 3.1.6 诱导表达条件的优化 |
| 3.1.7 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的 Western blot 分析 |
| 3.1.8 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的纯化 |
| 3.1.9 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的糖基化分析 |
| 3.1.10 抗 boIFN-λ3 多克隆抗体的制备 |
| 3.3 重组牛 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的表达 |
| 3.3.1 重组 boIFN-β的表达 |
| 3.3.2 重组 boIFN-α的表达 |
| 3.3.3 重组 boIFN-γ的表达 |
| 3.4 重组牛 IFN-λ3/IFN-α/IFN-β/IFN-γ生物学活性初步测定 |
| 3.5 重组牛 IFN-λ3 理化特性分析 |
| 3.6 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的细胞毒性检测 |
| 3.6.1 重组 boIFN-λ3 的细胞毒性检测 |
| 3.6.2 重组 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ细胞毒性检测 |
| 3.7 牛 IFN-λ3 可刺激细胞产生 Mx1 蛋白并活化 ISRE |
| 3.7.1 牛 IFN-λ3 刺激多种牛源细胞产生 Mx1 蛋白 |
| 3.7.2 牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均能够诱导 ISRE 启动子活性 |
| 3.8 重组牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 IBRV/FMDV 和 BVDV 活性 |
| 3.8.1 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 IBRV 活性 |
| 3.8.2 重组牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 FMDV 活性 |
| 3.8.3 重组 boIFN-λ3 条件性的抑制 cp 型和 ncp 型 BVDV 增殖 |
| 3.9 ncpBVDV 持续性细胞感染不影响重组牛 IFN-λ3 抗病毒活性 |
| 3.9.1 boIFN-λ3 压力筛选下 ncpBVDV 仍能建立持续性细胞感染状态 |
| 3.9.2 细胞感染 ncpBVDV 后不影响 boIFN-λ3 抗其他病毒活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 酵母分泌表达和纯化 |
| 4.2 重组牛 IFN-λ3 的理化特性和生物活性 |
| 4.3 牛 IFN-λ3 与 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较分析 |
| 4.4 牛 IFN-λ3 与 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ协同抗病毒研究 |
| 4.5 ncpBVDV 持续性细胞感染与 IFN-λ3 抗病毒的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要(ABSTRACT) |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 干扰素的分类及性质 |
| 1.1 Ⅰ型干扰素 |
| 1.2 Ⅱ型干扰素 |
| 1.3 Ⅲ型干扰素 |
| 2 干扰素的分子结构 |
| 3 干扰素的产生 |
| 4 干扰素的作用机制 |
| 4.1 干扰素受体 |
| 4.1.1 Ⅰ型干扰素受体 |
| 4.1.2 Ⅱ型干扰素受体 |
| 4.1.3 IFN-γ受体 |
| 4.2 干扰素的信号传导和效应途径 |
| 4.2.1 干扰素的信号传导 |
| 4.2.1.1 IFN-α/β |
| 4.2.1.2 IFN-γ |
| 4.2.2 效应途径 |
| 4.2.2.1 PKR途径 |
| 4.2.2.2 2'-5'OAS途径 |
| 4.2.2.3 Mx途径 |
| 5 IFN的生物学活性 |
| 5.1 抗病毒繁殖作用 |
| 5.2 抑制细胞分裂增殖、抗肿瘤作用 |
| 5.3 免疫凋节作用 |
| 5.4 免疫佐剂作用 |
| 5.5 干扰素与机体组织系统的相互作用和影响 |
| 5.5.1 干扰素信号的负调控因素 |
| 5.5.1.1 SOCS家族 |
| 5.5.1.2 PIAS家族 |
| 5.5.1.3 PTP家族 |
| 5.5.2 干扰素与神经内分泌系统的相互作用 |
| 5.5.3 病毒对干扰素的抵抗 |
| 5.5.3.1 转录水平的抑制—病毒阻抑干扰素的诱生 |
| 5.5.3.2 病毒对干扰素信号通路的抑制 |
| 5.5.3.3 病毒对干扰素效应蛋白的抑制 |
| 6 家禽α干扰素的研究概况 |
| 7 IFN的基因工程研究及应用 |
| 7.1 IFN的基因工程研究 |
| 7.2 干扰素的应用 |
| 7.3 干扰素临床应用中的副作用问题 |
| 8 α干扰素作为免疫佐剂的研究进展 |
| 9 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 9.1 分泌蛋白的翻译后修饰加工 |
| 9.2 影响外源蛋白表达的因素 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 鹅INF-α基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 方法设计 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养及细胞总RNA的提取 |
| 2.3.1 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养 |
| 2.3.2 细胞的诱导培养 |
| 2.3.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 天府肉鹅IFN-α基因的扩增 |
| 2.4.1 RT-PCR反应 |
| 2.4.2 PCR扩增目的片段及检测 |
| 2.4.3 扩增产物的纯化 |
| 2.5 干扰素基因的克隆与测序 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.5.2 PCR纯化产物与克隆载体的连接 |
| 2.5.3 连接产物的转化 |
| 2.5.4 阳性重组子的鉴定 |
| 2.5.4.1 质粒的提取 |
| 2.5.4.2 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的双酶切鉴定 |
| 2.5.4.3 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的PCR鉴定 |
| 2.5.5 序列测定 |
| 2.6 天府肉鹅干扰素α的生物信息学分析 |
| 2.6.1 tf-GoIFN-α ORF基因序列分裂 |
| 2.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 2.6.3 信号肽分析 |
| 2.6.4 糖基化位点分析 |
| 2.6.5 跨膜区预测 |
| 2.6.6 磷酸化位点预测 |
| 2.6.7 疏水性分析 |
| 2.6.8 亚细胞定位预测 |
| 2.6.9 抗原表位分析 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 2.6.11 同源性及进化树分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅外周血单核细胞诱导培养结果 |
| 3.2 天府肉鹅1FN-α基因PCR扩增 |
| 3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.5 tf-GoIFN-α基因序列 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.6.1 tf-GoIFN-αORF基因序列分析 |
| 3.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 3.6.2.1 不同动物IFN-α基因参数的分析 |
| 3.6.2.2 天府肉鹅IFN-α基因密码子使用频率 |
| 3.6.3 信号肽分析 |
| 3.6.4 糖基化位点分析 |
| 3.6.5 跨膜区预测 |
| 3.6.6 磷酸化位点预测 |
| 3.6.7 疏水性分析 |
| 3.6.8 抗原表位分析 |
| 3.6.9 亚细胞定位预测 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 3.6.11 同源性及进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 天府肉鹅IFN-α的诱导和产生 |
| 4.2 RNA的提取及基因扩增 |
| 4.3 天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析 |
| 4.4 天府肉鹅IFN-α基因的密码子特征 |
| 5 小结 |
| 第四章 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种、质粒及毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 成熟肽基因的扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.4 pMD18-T-mGoIFN-α和pET-32a(+)质粒的提取 |
| 2.1.5 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.1.6 目的基因(mGoIFN-α)和表达载体pET-32a(+)的连接 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 原核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.2.1 Rosetta感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 工程菌的诱导表达 |
| 2.2.3 诱导表达重组蛋白的条件优化 |
| 2.2.4 重组蛋白的纯化和复性 |
| 2.2.4.1 包涵体的制备 |
| 2.2.4.2 包涵体的洗涤 |
| 2.2.4.3 包涵体的溶解 |
| 2.2.4.4 透析复性 |
| 2.2.4.5 Ni-IMAC纯化复性 |
| 2.2.4.6 蛋白浓度的测定 |
| 2.3 高免血清的制备 |
| 2.3.1 蛋白疫苗的制备 |
| 2.3.2 动物免疫 |
| 2.3.3 高免血清效价检测 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素的抗病毒活性研究 |
| 2.4.1 天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 2.4.1.1 VSV的扩增与保存 |
| 2.4.1.2 原代鹅胚成纤维细胞的制备和培养 |
| 2.4.1.3 VSV半数细胞感染量(TCID50)测定 |
| 2.4.1.4 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性的测定 |
| 2.4.2 重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.1 GPV的接种、收获与毒价测定 |
| 2.4.2.2 荧光定量PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.4.2.2.2 标准阳性模板的制备 |
| 2.4.2.2.3 引物合理性验证及反应条件的优化 |
| 2.4.2.2.4 标准曲线制备 |
| 2.4.2.2.5 试验样品的制备 |
| 2.4.2.2.5.1 试验分组 |
| 2.4.2.2.5.2 样品制备 |
| 2.4.2.2.6 定量PCR检测 |
| 2.4.2.2.7 结果计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅IFN-α成熟蛋白基因片段的克隆 |
| 3.2 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 3.3 重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 诱导时间的优化 |
| 3.3.2 IPTG诱导浓度的优化 |
| 3.3.3 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因重组蛋白复性 |
| 3.4 高免血清效价测定 |
| 3.5 免疫兔血清的Western Blot检测 |
| 3.6 重组天府肉鹅α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 3.6.1 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 3.6.2 SYBR Green real-time PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 3.6.2.1 反应条件的优化 |
| 3.6.2.2 标准曲线的建立 |
| 3.6.2.3 溶解曲线分析 |
| 3.6.2.4 SYBR Green real-time PCR检测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于信号肽及成熟蛋白基因表达 |
| 4.2 关于蛋白的复性 |
| 4.3 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性 |
| 4.4 SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 5 小结 |
| 第五章 鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物\毒株 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔抗鹅IFN-α基因蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 实验动物准备 |
| 2.1.2 鹅卵黄IgG的提纯 |
| 2.1.3 鹅卵黄IgG的鉴定 |
| 2.1.4 蛋白含量的测定 |
| 2.1.5 蛋白疫苗的制备 |
| 2.1.6 动物免疫 |
| 2.1.7 血清的分离 |
| 2.1.8 兔抗鹅IgG效价的测定 |
| 2.1.9 兔血清IgG的纯化 |
| 2.1.9.1 用辛酸-硫酸铵法粗提血清IgG |
| 2.1.9.2 DEAEA-50纤维柱层析纯化兔抗鹅血清IgG |
| 2.1.9.2.1 纤维素平衡 |
| 2.1.9.2.2 离子交换层析纯化IgG |
| 2.2 兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 2.2.1 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.2.2 ELISA抗原的制备 |
| 2.2.3 间接ELISA操作方法 |
| 2.2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 免疫扩散试验 |
| 3.2 抗体纯化检测 |
| 3.4 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.5 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于血清IgG的纯化 |
| 4.2 关于ELISA条件的优化 |
| 4.3 关于酶标二抗 |
| 5 小结 |
| 第六章 天府肉鹅IFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 2.1.1 菌种的培养 |
| 2.1.2 pMD-18-T-GoIFN-α质粒的提取 |
| 2.1.3 目的基因的准备 |
| 2.1.4 pcDNA3.1(+)的线性化 |
| 2.1.5 pcDNA3.1(+)的去磷酸化 |
| 2.1.6 连接反应 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 真核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染COS-7细胞 |
| 2.2.1.1 真核表达质粒pcDNA3.1-goIFN-α的提取 |
| 2.2.1.2 COS-7细胞的准备 |
| 2.2.1.2.1 COS-7细胞复苏 |
| 2.2.1.2.2 转染前COS-7细胞的处理 |
| 2.2.1.3 脂质体法转染COS-7细胞 |
| 2.2.2 间接免疫荧光法检测pcDNA3.1-GoIFN-α的表达 |
| 2.2.3 ELISA法鉴定目的蛋白的分泌 |
| 2.2.4 Westem blot分析 |
| 2.3 pcDNA3.1-GoIFN-α生物活性的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 3.2 GoIFN-α基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 3.3 GoIFN-α基因表达产物在细胞上清液中的检测 |
| 3.4 Westem-blot分析 |
| 3.5 基因表达产物GoIFN-α抗病毒检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GoIFN-α外源蛋白在COS-7细胞中的表达 |
| 4.2 抗病毒活性的检测 |
| 5 小结 |
| 第七章 天府肉鹅IFN-α真核表达质粒的免疫佐剂效应 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌种、质粒和毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子佐剂和小鹅瘟VP3基因疫苗大量制备和纯化 |
| 2.1.1 碱裂解法提取质粒,大量制备基因疫苗及佐剂 |
| 2.1.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗及佐剂质粒 |
| 2.2 动物分组和免疫 |
| 2.3 血样的采集和处理 |
| 2.4 淋巴细胞转化试验 |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 检测及数据处理 |
| 2.5 血清IgG的变化 |
| 2.5.1 ELISA抗原的制备 |
| 2.5.2 血清抗体IgG检测 |
| 2.5.3 结果分析 |
| 2.6 中和抗体水平的检测 |
| 2.6.1 小鹅瘟强毒的培养 |
| 2.6.2 抗体水平检测 |
| 2.6.3 计算中和指数 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量的佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.2 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.3 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗及佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化结果 |
| 3.2.1 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.3 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.3 小鹅瘟强毒TCID_(50)的测定 |
| 3.4 中和抗体试验检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.2 关于IFN-α的分子免疫佐剂功能 |
| 5 小结 |
| 第八章 天府肉鹅α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种、质粒和病毒 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计及合成 |
| 2.1.2 基因扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.2 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.1 pMD18-T-m2GoIFN-α和pPICZαA质粒的提取 |
| 2.2.2 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.2.3 目的基因(mGoIFN-α)与表达载体pPICZαA的连接 |
| 2.2.4 连接产物的转化 |
| 2.2.5 酵母表达载体的鉴定 |
| 2.2.5.1 PCR鉴定 |
| 2.2.5.2 酶切鉴定 |
| 2.2.5.3 酵母表达载体的序列测定 |
| 2.3 天府肉鹅IFN-α在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3.1 重组酵母的构建 |
| 2.3.1.1 空载体pPICZαA及表达载体pPICZαA-GoIFN-α的线性化 |
| 2.3.1.1.1 SacⅠ单酶切 |
| 2.3.1.1.2 线性化质粒的纯化 |
| 2.3.1.2 受体菌X-33感受态细胞的制备 |
| 2.3.1.3 酵母菌的电转化 |
| 2.3.1.3.1 电转仪参数的设置 |
| 2.3.1.3.2 电转化操作 |
| 2.3.1.4 重组鹅α干扰素基因酵母菌株的鉴定 |
| 2.3.1.4.1 重组酵母基因组DNA的提取 |
| 2.3.1.4.2 PCR鉴定 |
| 2.3.2 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 2.3.2.1 Mut+型重组酵母菌株的初步表达 |
| 2.3.2.2 高拷贝重组酵母菌株的筛选 |
| 2.3.2.3 重组酵母菌株的表达条件的优化 |
| 2.3.2.3.1 诱导表达时间的优化 |
| 2.3.2.3.2 甲醇浓度的优化 |
| 2.3.2.3.3 双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化 |
| 2.3.3 重组酵母表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 |
| 2.3.3.1 配制SDS-PAGE凝胶 |
| 2.3.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3.3 表达产物的Western-blot分析 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素抗病毒活性检测 |
| 2.4.1 酵母表达产物的纯化 |
| 2.4.1.1 透析袋的预先处理 |
| 2.4.1.2 重组IFN-α的纯化 |
| 2.4.2 抗病毒活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 成熟肽基因的克隆 |
| 3.2 酵母表达载体的构建 |
| 3.3 酵母转化子的鉴定 |
| 3.4 斑点法筛选高表达菌株 |
| 3.5 诱导表达条件的优化 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE |
| 3.7 Western-blot检测 |
| 3.8 重组天府肉鹅IFN-α酵母表达产物的抗病毒活性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于表达系统的选择 |
| 4.2 关于毕赤酵母转化方法的选取 |
| 4.3 关于酵母表达的糖基化 |
| 4.4 天府肉鹅α干扰素酵母表达产物的抗病毒活性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间文章完成情况 |
（4）家蚕气味结合蛋白基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫的化学感受与嗅觉机制 |
| 1.1 昆虫的化学感受 |
| 1.2 昆虫的化学感受器与类型 |
| 1.3 昆虫化学感受的相关蛋白 |
| 1.3.1 昆虫的气味结合蛋白 |
| 1.3.2 昆虫的气味受体 |
| 1.3.3 昆虫的化学感受蛋白 |
| 1.3.4 气味降解酶 |
| 1.3.5 感觉神经元膜蛋白 |
| 1.4 昆虫的嗅觉机制 |
| 1.4.1 昆虫嗅觉途径 |
| 1.4.2 昆虫嗅觉感受模型 |
| 1.5 昆虫嗅觉机制前景和应用意义 |
| 2 RNAi 及其在昆虫学研究中的应用 |
| 2.1 RNAi 的发现与发展 |
| 2.2 RNAi 的分子机制 |
| 2.2.1 起始阶段 |
| 2.2.2 效应阶段 |
| 2.2.3 扩增阶段 |
| 2.3 RNAi 的生物学意义 |
| 2.3.1 RNAi 抵御病毒感染 |
| 2.3.2 RNAi 抑制转座子运动 |
| 2.3.3 RNAi 参与异染色质的形成与维持 |
| 2.3.4 RNAi 参与机体的发育调控及生理代谢 |
| 2.4 RNAi 的系统性 |
| 2.5 RNAi 在昆虫中导入方式 |
| 2.5.1 昆虫RNAi 的导入方式 |
| 2.5.1.1 注射法 |
| 2.5.1.2 饲喂法 |
| 2.5.1.3 组织培养法 |
| 2.6 RNAi 在家蚕中的应用及前景 |
| 3 家蚕的遗传标记 |
| 3.1 家蚕遗传学研究的概况 |
| 3.1.1 近代的家蚕遗传学研究概况 |
| 3.1.2 现代的家蚕遗传学研究概况 |
| 3.1.3 家蚕作为遗传学研究材料的优点 |
| 3.2 家蚕的遗传标记 |
| 3.2.1 形态标记 |
| 3.2.2 生化标记 |
| 3.2.3 细胞学标记 |
| 3.2.4 分子标记 |
| 第二章 主要试剂与常用实验方法 |
| 1 常用试剂 |
| 1.1 培养基 |
| 1.1.1 LB 液体培养基（Luria-Bertani Medium） |
| 1.1.2 LB 固体培养基 |
| 1.2 常用溶液 |
| 1.2.1 Tris·EDTA(TE)缓冲液（pH8.0） |
| 1.2.2 碱变性法质粒抽提缓冲液 |
| 1.2.3 氨苄青霉素(ampicillin,Amp) |
| 1.2.4 RNaseA |
| 1.2.5 CaCl_2(75 mmol/L) |
| 1.2.6 3 mol/L NaAc(pH 5.2) |
| 1.2.7 溴化乙锭(ethidium bromide,EB) |
| 1.2.8 X-gal(2%,m/v) |
| 1.2.9 IPTG |
| 1.2.10 1.2 %琼脂糖(Agarose) |
| 1.2.11 DEPC 处理水 |
| 1.2.12 TAE 电泳缓冲液(50×储存液,pH 约 8.5) |
| 2 主要仪器设备 |
| 3 常用实验方法 |
| 3.1 碱裂解法少量制备质粒DNA |
| 3.2 家蚕组织总RNA 提取 |
| 3.3 家蚕DNA 提取 |
| 3.4 CaC1_2 法制备E.coli 感受态细胞 |
| 3.5 Reverse Transcription-PCR 反应（RT-PCR） |
| 3.6 PCR 扩增反应程序及加样体系 |
| 3.7 PCR 产物的回收 |
| 3.8 连接反应 |
| 3.9 重组DNA 的转化 |
| 3.10 重组质粒的筛选 |
| 3.11 限制性内切酶反应 |
| 3.12 家蚕OBP 基因表达半定量分析 |
| 第三章 家蚕OBP 家族的生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要数据库及软件 |
| 1.1.1 数据库及网址 |
| 1.1.2 所用生物信息学软件 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 家蚕OBP 家族核苷酸序列分析 |
| 2.1.1 家蚕OBP 家族基因染色体定位 |
| 2.1.2 家蚕OBP 家族基因结构分析 |
| 2.1.3 家蚕OBP 家族基因电子表达谱分析 |
| 2.1.4 家蚕OBP 家族基因进化分析与遗传距离 |
| 2.2 家蚕OBP 家族蛋白序列分析 |
| 2.2.1 家蚕OBP 蛋白生化特征 |
| 2.2.2 家蚕OBP 蛋白跨膜区和疏水性预测 |
| 2.2.3 家蚕OBP 蛋白氨基酸序列分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 家蚕潜成虫和成虫期PBP/GOBP 亚家族基因簇基因定位、表达与蚕蛾趋性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 PBP/GOBP 亚家族基因序列获取与染色体定位 |
| 1.2 家蚕品种与组织选取和RT-PCR |
| 1.3 基因表达水平分析 |
| 1.4 家蚕蛾的趋性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 家蚕PBP/GOBP 亚家族基因簇基因在染色体上的定位与排布分析 |
| 2.2 家蚕PBP/GOBP 亚家族基因表达谱分析 |
| 2.2.1 羽化前1 天家蚕PBP/GOBP 亚家族基因的表达分析 |
| 2.2.2 羽化当日家蚕PBP/GOBP 亚家族基因的表达分析 |
| 2.2.3 家蚕蛹和成虫不同时期触角中PBP/GOBP 亚家族基因的表达分析 |
| 2.2.4 家蚕蛾的趋性测定 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 家蚕PBP/GOBP 基因簇 |
| 3.2 家蚕PBP/GOBP 基因簇基因的表达与功能分析 |
| 第五章 家蚕ABP 和ABPX 的表达与功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 家蚕ABP 和ABPX 的序列、结构与功能位点分析 |
| 1.2 不同发育阶段家蚕ABP 和ABPX 基因表达分析 |
| 1.3 基于RNAi 的家蚕ABP 和ABPX 功能研究 |
| 1.3.1 注射化学合成的dsRNA 研究家蚕ABP 和ABPX 的功能 |
| 1.3.2 口服细菌表达的dsRNA 研究家蚕ABP 和ABPX 的功能 |
| 1.3.3 RNAi 对家蚕对桑叶趋性的影响 |
| 1.3.4 RNAi 对家蚕发育的影响 |
| 1.3.5 RNAi 对基因表达的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 家蚕ABP 和ABPX 的序列、结构与功能位点分析 |
| 2.2 不同发育阶段家蚕ABP 和ABPX 基因表达分析 |
| 2.2.1 家蚕胚胎期ABP 和ABPX 基因的表达 |
| 2.2.2 家蚕幼虫不同时期ABP 和ABPX 基因的表达 |
| 2.2.3 5 龄中期不同组织器官ABP 和ABPX 基因的表达 |
| 2.3 家蚕ABP 和ABPX 的RNAi |
| 2.3.1 dsRNA 的合成与家蚕的处理 |
| 2.3.2 注射dsRNA 对家蚕的影响 |
| 2.3.3 口服细菌表达的dsRNA 对家蚕的影 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 家蚕ABP 和ABPX 基因表达与功能分析 |
| 3.2 家蚕ABP 和ABPX 的RNAi 系统性与效应 |
| 3.3 口服细菌表达载体产生的dsRNA 用于昆虫RNAi 分析 |
| 第六章 野桑蚕pbp、or1 和or3 基因的克隆与进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 野桑蚕蛾 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 野桑蚕基因的克隆与测序 |
| 1.4 基因序列分析 |
| 1.5 遗传距离和进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 野桑蚕和家蚕的PBP 和OR 基因变异分析 |
| 2.2 野桑蚕和家蚕的PBP 成熟蛋白和OR 蛋白的二级结构分析 |
| 2.3 野桑蚕和家蚕同源基因遗传距离分析 |
| 2.4 进化速率 |
| 2.5 5 种昆虫PBP 蛋白进化分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 野桑蚕和家蚕的基因的变异及其与蛋白质功能的关系 |
| 3.2 野桑蚕和家蚕PBP 亚家族基因的进化比较 |
| 第七章 昆虫GOBP 的分子进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 GOBP 蛋白及cDNA 序列获取 |
| 1.2 13 个物种GOBP 的氨基酸同源比对及聚类分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 13 种昆虫GOBP 蛋白的聚类分析及氨基酸同源比对 |
| 2.1.1 13 种昆虫GOBP 聚类分析 |
| 2.1.2 13 种昆虫GOBP 蛋白氨基酸和核苷酸序列一致性与差异性分析 |
| 2.1.3 13 种昆虫GOBP 蛋白序列的遗传距离分析 |
| 2.1.4 13 种昆虫GOBP 氨基酸残基替代分析 |
| 2.2 13 种昆虫GOBP 蛋白基于氨基酸序列的ω分析 |
| 2.3 13 种昆虫GOBP 蛋白氨基酸序列分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第八章 家蚕食性相关分子标记研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 家蚕品系及对人工饲料的摄食性鉴定 |
| 1.2 家蚕DNA 提取与检测 |
| 1.3 分子标记PCR |
| 1.3.1 引物设计 |
| 1.3.2 RAPD-PCR 反应体系及条件设置 |
| 1.3.3 SSR-PCR 反应体系及条件设置 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 家蚕高摄食性和低摄食性纯系的摄食性调查 |
| 2.2 家蚕DNA 检测 |
| 2.3 分子标记分析 |
| 2.3.1 RAPD 标记分析 |
| 2.3.2 SSR 标记分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第九章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文与研究成果 |
（5）植酸酶高效生产菌株74#的改良（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.1.1 甲醇代谢途径 |
| 1.1.2 表达系统的组成 |
| 1.1.3 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素 |
| 1.1.4 蛋白质二硫键异构酶PDI 的作用 |
| 1.1.5 透明颤菌血红蛋白(VHb)的作用 |
| 1.2 重组植酸酶的研究进展 |
| 1.2.1 植酸酶来源和分类 |
| 1.2.2 大肠杆菌来源的植酸酶基因 |
| 1.2.3 植酸酶基因工程 |
| 1.2.4 植酸酶的应用 |
| 1.3 本论文研究目的和意义 |
| 第二章 共表达蛋白质二硫键异构酶对重组酵母中植酸酶 AppA 表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PDI 编码基因的克隆与分析 |
| 2.2.2 重组表达载体pPICZA-pdi 的构建及酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组酵母的获得及筛选 |
| 2.2.4 发酵罐水平植酸酶的表达 |
| 2.2.5 重组酵母中appA-m, pdi 基因的PCR 检测分析 |
| 2.2.6 重组酵母菌株中二硫键异构酶PDI 的Western blot 分析 |
| 2.2.7 PDI 共表达对重组酵母菌体生长的影响 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 增加植酸酶 AppA 基因的拷贝数对其表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 酵母表达载体的构建 |
| 3.2.2 重组酵母的获得与筛选 |
| 3.2.3 重组菌株在发酵罐水平的表达研究 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 共表达透明颤菌血红蛋白(VHb)对重组酵母中植酸酶 AppA 表达的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 血红蛋白基因的合成 |
| 4.2.2 低氧启动子的克隆及表达载体的构建 |
| 4.2.3 重组酵母的获得和筛选 |
| 4.2.4 重组酵母中appA, vgb 基因的PCR 检测分析 |
| 4.2.5 酵母菌株中血红蛋白VHb 的Western blot 分析 |
| 4.2.6 VHb 共表达对重组酵母菌株生长的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 植酸酶appA-m 基因在 Pichia pastoris 细胞上的表面展示 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 AGα1 基因的克隆 |
| 5.2.2 植酸酶基因appA-m 表面展示载体的构建 |
| 5.2.3 重组酵母的获得及筛选 |
| 5.2.4 表面展示植酸酶AppA 的酶学性质测定 |
| 5.3 本章小结 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白转导功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一篇 文献综述部分 |
| 综述一 α疱疹病毒的被膜蛋白 |
| 1 概述 |
| 2 主要被膜蛋白及其功能 |
| 3 被膜蛋白的相互关系 |
| 4 被膜蛋白参与病毒的复制和传播 |
| 5 被膜蛋白功能研究的战略意义 |
| 综述二 疱疹病毒VP22蛋白转导功能及其应用 |
| 1 蛋白转导域的概念 |
| 2 VP22 的蛋白转导功能 |
| 3 VP22 的应用前景和存在的问题 |
| 第二篇 研究内容部分 |
| 第一章 不同致病型马立克氏病病毒VP22 蛋白的序列比较和分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果和分析 |
| 第二章 CV1988 弱毒疫苗株VP22 羧基端原核表达及特异性抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 MDV-1 VP22 在真核系统中的表达和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 CV1988 VP22 蛋白转导功能的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 CV1988 VP22 转导一些蛋白的初步鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 CV1988 VP22增强IBDV VP2基因免疫效果的评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表的学术论文及着作目录 |
（7）重组人透明带蛋白3的高密度发酵表达及食蟹猴的免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 1.1 卵透明带简述 |
| 1.1.1 卵透明带蛋白 |
| 1.1.2 卵透明带在精卵结合中的作用 |
| 1.1.3 透明带蛋白的基因及其在体内的表达 |
| 1.1.4 ZP蛋白作为抗生育疫苗的潜力 |
| 1.2 重组ZP蛋白的研究 |
| 1.3 本研究课题的立论依据、目的及意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 2. 仪器、材料与试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 主要试剂 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 构建重组基因表达质粒 |
| 3.1.1 PCR扩增目的基因片段——人卵透明带ZP3蛋白基因片段 |
| 3.1.2 载体pPICZαA的制备 |
| 3.1.3 扩增片段和载体的双酶切 |
| 3.1.4 外源基因与载体的连接 |
| 3.1.5 氯化钙法制备大肠杆菌Top10感受态细胞 |
| 3.1.6 大肠杆菌Top10的转化 |
| 3.1.7 转化子的检测和鉴定 |
| 3.2 重组外源基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达 |
| 3.2.1 酵母细胞的转化 |
| 3.2.2 阳性克隆的筛选 |
| 3.2.3 表达蛋白的鉴定 |
| 3.3 工程菌发酵罐高密度培养 |
| 3.4 猴抗重组人卵透明带蛋白(rhZP3)抗血清的制备和鉴定 |
| 3.4.1 抗原乳剂的制备 |
| 3.4.2 实验动物准备 |
| 3.4.3 免疫途径和方法 |
| 3.4.4 ELISA检测抗血清效价 |
| 3.4.5 抗rhZP3抗血清的免疫组化鉴定 |
| 3.4.6 猴抗rhZP3抗血清对小鼠精卵结合的影响 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 重组质粒的构建 |
| 4.1.1 目的基因片段的PCR扩增结果 |
| 4.1.2 重组质粒的构建及鉴定结果 |
| 4.1.3 重组质粒的酶切结果 |
| 4.1.4 重组质粒的测序 |
| 4.2 毕赤酵母的转化 |
| 4.2.1 PCR鉴定重组酵母 |
| 4.2.2 多拷贝转化子的筛选 |
| 4.2.3 hZP3基因在酵母中的表达 |
| 4.3 重组酵母高密度发酵条件的优化及重组蛋白的表达 |
| 4.3.1 接种初始pH对进入对数增长期时间的影响 |
| 4.3.2 诱导启动时间对表达量的影响 |
| 4.3.3 甲醇诱导时间 |
| 4.4 rhZP3免疫食蟹猴的研究 |
| 4.4.1 动物的免疫 |
| 4.4.2 抗体滴度的检测 |
| 4.4.3 抗体的免疫组化检测 |
| 4.4.4 猴抗rhZP3抗血清对小鼠精卵结合的影响 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 毕赤酵母工程菌的构建 |
| 5.2 高密度发酵表达与纯化 |
| 5.3 免疫食蟹猴 |
| 5.4 抗rhZP3抗血清的生物学活性 |
| 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 附录一 常用试剂的配制方法 |
| 附录二 重组质粒测序结果及氨基酸序列 |
| 附录三 缩略词表 |
| 附录四 在校期间发表研究论文情况 |
| 致谢 |
（8）抑制素基因疫苗pCISI免疫南阳黄牛试验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述:肉牛人工孪生和抑制素基因免疫研究进展 |
| 1 诱导肉牛孪生的意义及研究进展 |
| 1.1 诱导肉牛孪生的意义 |
| 1.2 肉牛孪生技术研究进展 |
| 1.2.1 双胎遗传选择 |
| 1.2.2 激素诱导 |
| 1.2.3 胚胎移植 |
| 1.2.4 激素免疫 |
| 2 抑制素基因免疫研究进展 |
| 2.1 抑制素免疫 |
| 2.1.1 抑制素结构与生理功能 |
| 2.1.2 抑制素免疫原 |
| 2.1.3 抑制素常规免疫各种雌性动物的效果 |
| 2.1.3.1 抑制素免疫母牛的效果 |
| 2.1.3.2 抑制素免疫其它雌性动物的效果 |
| 2.2 抑制素基因免疫 |
| 2.2.1 抑制素基因免疫概述 |
| 2.2.2 抑制素基因免疫对动物的影响 |
| 2.2.3 影响抑制素基因免疫效果的因素 |
| 2.2.3.1 疫苗性质 |
| 2.2.3.2 疫苗剂量 |
| 2.2.3.3 疫苗纯度 |
| 2.2.3.4 免疫方法和程序 |
| 2.2.3.5 免疫途径 |
| 2.2.3.6 免疫佐剂 |
| 2.2.3.7 动物品种和个体差异 |
| 2.2.4 抑制素基因免疫质粒pCISI |
| 2.2.4.1 pCISI的构建 |
| 2.2.4.2 pCISI的提取与纯化 |
| 2.2.4.3 PCISI的试验研究 |
| 3 B超诊断技术在母牛繁殖上的应用 |
| 3.1 B超监测卵巢、卵泡和黄体 |
| 3.2 B超监测早期妊娠、胚胎发育及子宫疾病 |
| 第二篇 实验研究 |
| 实验一 南阳黄牛对抑制素基因疫苗pCISI的免疫反应性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 抑制素基因疫苗pCISI质粒DNA的大量制备与提纯 |
| 1.2.1 质粒的大量培养 |
| 1.2.2 质粒的抽提与纯化 |
| 1.2.3 质粒浓缩与质量监控 |
| 1.2.4 质粒的包裹 |
| 1.3 动物的分组 |
| 1.4 免疫及采血程序 |
| 1.5 抗体检测 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pCISI抑制素基因免疫对黄牛抗体P/N值的影响 |
| 2.1.1 不同剂量的抑制素质粒pCISI免疫对黄牛抗体 P/N值的影响 |
| 2.1.2 不同纯度的抑制素质粒pCISI对黄牛抗体 P/N值的影响 |
| 2.1.3 黄牛在不同免疫阶段的抗抑制素抗体 P/N值 |
| 2.2 双拷则印制素pCISI基因免疫诱导的抗体阳性牛比例 |
| 2.2.1 不同剂量的pCISI免疫后抗抑制素抗体阳性牛比例 |
| 2.2.2 不同纯度的pCISI免疫后抗抑制素抗体阳性牛比例 |
| 2.2.3 不同免疫阶段的抗抑制素抗体阳性牛比例 |
| 3 讨论 |
| 3.1 抑制素基因免疫黄牛的免疫原性 |
| 3.2 疫苗剂量对免疫效果的影响 |
| 3.3 疫苗纯度对免疫效果的影响 |
| 3.4 加强免疫对免疫效果的影响 |
| 实验二 抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖及生殖内分泌的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验动物分组 |
| 1.3 免疫及采血程序 |
| 1.4 卵泡发育情况检测 |
| 1.5 早期妊娠诊断 |
| 1.6 血样检测 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖的影响 |
| 2.1.1 抑制素pCISI基因免疫对发情黄牛卵泡发育的影响 |
| 2.1.2 抑制素pCISI基因免疫对妊娠黄牛胎儿数目的影响 |
| 2.2 抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖激素的影响 |
| 2.2.1 抑制素pCISI基因免疫对促卵泡素(FSH)的影响 |
| 2.2.2 抑制素pCISI基因免疫对雌二醇(E2)的影响 |
| 2.2.3 抑制素pCISI基因免疫对孕酮(P)的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 双拷备抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖活动的影响 |
| 3.1.1 抑制素pCISI基因免疫对黄牛卵泡发育的影响 |
| 3.1.2 抑制素pCISI基因免疫对黄牛胎儿数量的影响 |
| 3.1.3 抑制素基因免疫剂量与黄牛卵泡、胚胎发育的关系 |
| 3.1.4 抑制素基因疫苗纯度与黄牛卵泡、胚胎发育的关系 |
| 3.1.5 黄牛生殖与抑制素抗体水平的相关性 |
| 3.1.6 抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖活动的安全性 |
| 3.2 双拷备抑制素pCISI基因免疫对黄牛生殖激素的影响 |
| 3.2.1 抑制素pCISI基因免疫对黄牛血清FSH的影响 |
| 3.2.2 抑制素pCISI基因免疫对黄牛血清雌二醇的影响 |
| 3.2.3 抑制素pCISI基因免疫对黄牛血清孕酮的影响 |
| 3.2.4 抑制素基因免疫剂量与黄牛生殖内分泌的关系 |
| 3.2.5 抑制素基因疫苗纯度与黄牛生殖内分泌的关系 |
| 3.2.6 黄牛生殖内分泌与抑制素抗体水平的相关性 |
| 3.3 pCISI加强免疫对免疫效果的影响 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）牛骨形态发生蛋白BMP-4 cDNA的克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 1.1 骨形态发生蛋白（BMP）的研究进展 |
| 1.1.1 BMP 的发现简史 |
| 1.1.2 组织分布 |
| 1.1.3 染色体定位 |
| 1.1.4 BMP 的结构 |
| 1.1.5 BMP 的生物学功能 |
| 1.2 骨形态发生蛋白4（BMP-4）的研究进展 |
| 1.2.1 BMP-4 的分子生物学特征 |
| 1.2.2 BMP-4 的生物学作用 |
| 1.3 全长cDNA 的获得——RACE 技术的方法及其进展 |
| 1.3.1 RACE 技术的原理 |
| 1.3.2 RACE 的优点 |
| 1.3.3 RACE 的改良方法 |
| 1.4 本研究的目的、意义及研究方法 |
| 1.5 骨形态发生蛋白的研究方向 |
| 2 实验一牛骨形态发生蛋白4（BMP-4）基因部分cDNA 的克隆 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和克隆载体 |
| 2.1.2 实验动物组织样与血样 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂和溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR 引物的设计及合成 |
| 2.2.2 牛血DNA 的提取 |
| 2.2.3 PCR 反应 |
| 2.2.4 DNA 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 牛BMP-4 基因cDNA 的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.2.6 PCR 产物的序列测定 |
| 2.2.7 序列分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 总DNA 提取结果 |
| 2.3.2 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.3 扩增产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.3.4 测序及序列分析 |
| 3 牛BMP-4 基因3′端cDNA 序列的RACE 克隆及序列分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和克隆载体 |
| 3.1.2 实验动物组织样 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 主要试剂和溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RACE 引物的设计及合成 |
| 3.2.2 RNA 酶的灭活 |
| 3.2.3 牛胎儿软骨总RNA 的提取 |
| 3.2.4 牛BMP-4 基因3′端cDNA 的扩增 |
| 3.2.5 RACE 产物的克隆、筛选及鉴定 |
| 3.2.6 DNA 序列测定 |
| 3.2.7 序列分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 总RNA 提取结果 |
| 3.3.2 RT-PCR 扩增结果及RACE 体系的建立 |
| 3.3.3 扩增产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 |
| 3.3.4 3′RACE 产物的测序及序列分析结果 |
| 3.3.5 牛BMP-4 cDNA 序列及同源性比较 |
| 3.3.6 不同生物BMP-4 氨基酸序列同源性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BMP-4 cDNA 的3ˊ端序列及同源性比较（BMPs） |
| 4.2 牛BMP-4 蛋白的同源性分析 |
| 4.3 引物的设计 |
| 4.4 模板RNA 的质量 |
| 4.5 使用模板RNA 的策略 |
| 4.6 3′RACE 技术的应用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（10）人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达及其纯化（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文文摘 |
| 序言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 基因工程制药的研究概况 |
| 2 骨形态发生蛋白的研究与应用 |
| 2.1 BMPs及其受体 |
| 2.2 BMPs的生物学特性 |
| 2.3 BMPs在临床应用中的研究 |
| 3 毕赤酵母真核表达系统 |
| 3.1 几种不同表达体系和毕赤酵母表达系统的特性及比较 |
| 3.2 毕赤酵母表达系统的特点 |
| 3.3 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素 |
| 第二部分 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 工具酶 |
| 1.3 其它试剂 |
| 1.4 常用培养基和缓冲液 |
| 1.5 寡聚核甘酸引物 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 表达质粒的制备 |
| 2.2 重组质粒转化酵母感受态细胞 |
| 2.3 重组酵母的筛选 |
| 2.4 重组酵母细胞的诱导表达 |
| 2.5 表达产物的鉴定 |
| 2.6 发酵条件的优化 |
| 2.7 表达产物的分离纯化 |
| 2.8 纯化产物的处理 |
| 2.9 表达产物的定量分析 |
| 2.10 纯化蛋白的理化性质检测 |
| 第三部分 结果与分析 |
| 1 表达质粒的制备 |
| 2 酵母转化子筛选及鉴定 |
| 2.1 酵母转化子的筛选工作汇总 |
| 2.2 PCR筛选及鉴定 |
| 2.3 SDS-PAGE鉴定 |
| 2.4 Dot-Blotting鉴定 |
| 3 发酵条件的优化 |
| 3.1 不同初始pH值的培养基对蛋白表达的影响 |
| 3.2 初始诱导时的菌体密度(诱导OD)对蛋白表达的影响 |
| 3.3 甲醇诱导时间对蛋白表达的影响 |
| 3.4 甲醇诱导浓度对蛋白表达的影响 |
| 4 表达产物的柱层析法纯化 |
| 5 纯化产物的鉴定 |
| 5.1 SDS-PAGE鉴定 |
| 5.2 Western Blotting鉴定 |
| 6 表达产物的定量分析 |
| 7 纯化产物rhBMP4和rhBMP7的表观特征与溶解性 |
| 第四部分 小结与讨论 |
| 1 菌株表型 |
| 2 外源基因 |
| 3 转化效率 |
| 4 培养基 |
| 5 pH值 |
| 6 菌体密度 |
| 7 甲醇浓度 |
| 8 表达量 |
| 9 糖基化 |
| 英文缩略词表 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 致谢 |
四、hBMP-3成熟肽与人PDI分子片段在大肠杆菌中的共表达（论文参考文献）
- [1]小麦蛋白质二硫键异构酶的表达与性质研究及其对面粉品质的影响[D]. 张婷婷. 华南理工大学, 2014(02)
- [2]重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究[D]. 张润祥. 东北农业大学, 2013(08)
- [3]天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D]. 刘菲. 四川农业大学, 2011(02)
- [4]家蚕气味结合蛋白基因的研究[D]. 张升祥. 山东农业大学, 2009(06)
- [5]植酸酶高效生产菌株74#的改良[D]. 唐辉桂. 中国农业科学院, 2008(10)
- [6]MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白转导功能研究[D]. 陈鸿军. 扬州大学, 2006(03)
- [7]重组人透明带蛋白3的高密度发酵表达及食蟹猴的免疫研究[D]. 李文星. 暨南大学, 2006(05)
- [8]抑制素基因疫苗pCISI免疫南阳黄牛试验研究[D]. 崔先利. 南京农业大学, 2006(02)
- [9]牛骨形态发生蛋白BMP-4 cDNA的克隆及序列分析[D]. 刘永斌. 内蒙古农业大学, 2005(05)
- [10]人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达及其纯化[D]. 陈雅娟. 福建师范大学, 2004(04)